內(nèi)皮抑素對ACHN RCC中缺氧誘導(dǎo)因子和血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響.pdf

1、目的：利用已構(gòu)建的帶有內(nèi)皮抑素基因真核表達(dá)載體質(zhì)粒導(dǎo)入裸鼠ACHN RCC中，研究內(nèi)皮抑素基因?qū)θ毖跽T導(dǎo)因子和血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響。
　　 方法：
　　 1.質(zhì)粒的制備將含有pSecES和pcDNA3.1 質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a在LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以堿性裂解法制備質(zhì)粒，PEG 沉淀法純化，其OD 值介于1.8-1.9，臨用前調(diào)整濃度至1ug/ul。
　　 2.腫瘤模型的制備將ACHN細(xì)胞在含10％胎牛血清

2、的MEM 培養(yǎng)基(GibcoBRL公司)中在37℃5[％]的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長到對數(shù)生長期，PBS 洗滌，并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10 7個/L，在裸鼠右側(cè)背部皮下注射0.2ml，總共注射24只裸鼠。
　　 于接種腫瘤細(xì)胞7天后，腫瘤體積達(dá)到60～80mm 3，此時開始實驗干預(yù)3.實驗分組和干預(yù)將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為3組，每組8只。干預(yù)組：每只裸鼠瘤內(nèi)注射復(fù)合物100ul，含30ul 梭華－Sofast tm和30ug p

3、SecES 質(zhì)粒；對照組：每只裸鼠瘤內(nèi)注射復(fù)合物100ul，含30ul 梭華－Sofast tm和30ug pcDNA3.1 質(zhì)粒；空白組：裸鼠不進(jìn)行任何干預(yù)。各組每只裸鼠間隔3 天注射一次，連續(xù)注射3 次。觀察裸鼠一般情況。
　　 4.HE 染色和免疫組織化學(xué)染色于接種后第34 天斷頸處死裸鼠，解剖皮下腫瘤并稱瘤重，取腫瘤組織入4％多聚甲醛液固定，石蠟包埋，5um 切片。相鄰切片進(jìn)行病理組織檢查，同時分別以兔抗鼠角蛋白-18

4、抗體，兔抗鼠缺氧誘導(dǎo)因子2a(HIF-2 α)抗體，兔抗鼠VEGF 抗體為一抗。按SP法進(jìn)行免疫組化染色，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染。
　　 5.結(jié)果判定每只動物腫瘤組織切片隨機(jī)選取3 張，每張切片隨機(jī)選取7個視野，采用Image-pro plus 5.0.1 系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，選取每張切片的空白處進(jìn)行校正，以3 張切片的平均值作為該例腫瘤組織免疫組化陽性強(qiáng)度的平均積分密度。HIF表達(dá)為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒狀物，胞漿內(nèi)亦

5、有部分棕黃色顆粒表達(dá)。VEGF的特異性免疫反應(yīng)產(chǎn)物分布在細(xì)胞胞漿內(nèi)，為棕黃色顆粒。
　　 結(jié)果：
　　 1.HE 染色和keratin-18 免疫組化染色均符合RCC 特征。
　　 2.干預(yù)組、對照組、空白組腫瘤組織中的HIF-2 α平均積分光密度分別為5.36±0.59，6.28±0.76，6.4±0.77。干預(yù)組腫瘤HIF-2 α表達(dá)明顯減少，經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)=5.124，P<0.05.
　　 3

6、.干預(yù)組、對照組、空白組腫瘤組織中的VEGF平均積分光密度分別為18.68±2.11，22.45±2.51，22.11±2.55。干預(yù)組腫瘤VEGF表達(dá)明顯減少，經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)=5.666，P<0.05.
　　 4.荷瘤期間裸鼠毒副作用的觀察，荷瘤期裸鼠活動良好，無腹瀉等不良反應(yīng)。
　　 結(jié)論：
　　 1 .內(nèi)皮抑素基因通過持續(xù)分泌內(nèi)皮抑素抑制裸鼠ACHN RCC 腫瘤的生長，HIF-2 α、VEGF表達(dá)減