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文檔簡介
1、目的:
糖尿病是一種慢性代謝性疾病,流行范圍廣泛,對生命健康影響很大。2型糖尿病是心血管疾病最重要的危險因素之一,糖尿病如果控制不良會導致冠心病、視網(wǎng)膜眼底病變、腎臟血管病、糖尿病足等病癥。超過一半的2型糖尿病患者最終因為罹患心肌梗死、中風等心血管并發(fā)癥而死亡。動脈粥樣硬化、血管內(nèi)皮細胞功能紊亂、細胞凋亡等在糖尿病性心血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用,在血管內(nèi)膜發(fā)生破壞早期便可以檢測到內(nèi)皮細胞凋亡。
DPP4(d
2、ipeptidyl peptidase-4,二肽基肽酶4)抑制劑是一類口服降糖藥物,具有降低血糖效果明顯、致低血糖發(fā)生率低、不引起體重增加等優(yōu)點,被用于糖尿病治療中。近期研究發(fā)現(xiàn),DPP4抑制劑除了降糖作用之外,尚具有心血管保護功能,能夠改善內(nèi)皮細胞功能紊亂、增強內(nèi)皮eNOS磷酸化水平和減少動脈粥樣硬化斑塊大小。DPP4抑制劑甚至能夠改善心衰的嚴重程度。但是,目前對DPP4抑制劑在內(nèi)皮細胞凋亡調(diào)控中的作用及其分子學機制尚不可知。AMPK
3、(AMP-activated protein kinase,AMP依賴性的蛋白激酶)是生物體內(nèi)一種重要的細胞能量和應激的感受分子,是細胞能量代謝調(diào)節(jié)的重要調(diào)節(jié)體。既往研究發(fā)現(xiàn),AMPK的激活與心血管代謝性疾病密切相關(guān)。在HUVEC細胞中,AMPK的磷酸化激活可以顯著的改善氧化應激引起的細胞凋亡,血管AMPK的失調(diào)與血管病密切相關(guān),AMPK的調(diào)節(jié)在心血管代謝性疾病和細胞凋亡中具有重要的作用。
在本研究中,試圖揭示DPP4抑制劑在
4、內(nèi)皮細胞凋亡調(diào)控中的作用,探索AMPK在該調(diào)控過程中的角色,并對其可能分子學機制進行研究。
方法:
1.DPP4抑制劑對ROS(relative oxygen species,活性氧)、線粒體膜電位、細胞凋亡的影響
將人臍靜脈內(nèi)皮細胞分為三組,分別為空白對照組、高糖刺激組、DPP4抑制劑組。高糖刺激組加入葡萄糖(33 mM),DPP4抑制劑組加入西格列汀(1μM),置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后,利用流式細胞
5、儀檢測技術(shù)對活內(nèi)皮細胞的ROS、線粒體膜電位、細胞凋亡情況進行檢測。選用H2DCFDA熒光探針作為標記物檢測內(nèi)皮細胞內(nèi)ROS,采用JC-1熒光探針對線粒體膜電位水平進行檢測,選用AnnexinⅤ-FITC/PI雙標記熒光素探針對活細胞凋亡情況進行檢測。
2.DPP4抑制劑對AMPK活化的影響
A:檢測西格列汀隨時間增加對AMPK磷酸化的影響。在內(nèi)皮細胞中加入西格列汀(1μM),分別培養(yǎng)30 min、1h、2h、4h,
6、并且設置AMPK激動劑AICAR(100μM)培養(yǎng)30 min作為陽性對照。采用western blot技術(shù)檢測AMPK的磷酸化水平程度。
B:檢測AMPK抑制劑compound C對DPP4介導的AMPK磷酸化的作用。分為空白對照組、西格列汀組、AMPK抑制劑組、compound C對照組。西格列汀組加入西格列汀(1μM)、AMPK抑制劑組加入西格列?。?μM)和compound C(10μM)、compound C對照組加
7、入compound C(10μM),培養(yǎng)2h,采用western blot技術(shù)檢測AMPK的磷酸化水平程度。
3.AMPK在DPP4抑制劑調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞凋亡中的作用
將內(nèi)皮細胞分為空白對照組、高糖刺激組、DPP4抑制劑組、AMPK抑制劑組、AMPK激動劑組。利用流式細胞儀檢測技術(shù),分別檢測各處理ROS、線粒體膜電位、細胞凋亡情況。
結(jié)果:
1.給予內(nèi)皮細胞高葡萄糖刺激,可以引起細胞ROS水平升高,線
8、粒體膜電位破壞、細胞凋亡增強;
2.在高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞中加入DPP4抑制劑西格列汀可以降低細胞胞內(nèi)ROS水平,改善線粒體膜電位破壞,有效的降低細胞凋亡比率;
3.西格列汀可以增強AMPK的磷酸化,從30min開始,持續(xù)增強到2h。AMPK抑制劑compound C可以有效的減弱西格列汀介導產(chǎn)生的AMPK磷酸化;
4.AMPK抑制劑compoundC可以逆轉(zhuǎn)高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞中,西格列汀介導的內(nèi)皮ROS水平
9、降低、線粒體膜電位破壞改善和細胞凋亡減輕的益處。AMPK激動劑AICAR表現(xiàn)出與西格列汀相同的降低ROS水平、改善線粒體膜電位破壞和減弱內(nèi)皮細胞凋亡的作用。
結(jié)論:
1.實驗結(jié)果顯示,DPP4抑制劑西格列汀可以有效的減弱高糖刺激引起的ROS水平升高、線粒體膜電位破壞和內(nèi)皮細胞凋亡;
2.研究揭示了一種新穎的機制,DPP4抑制劑西格列汀在內(nèi)皮細胞凋亡調(diào)節(jié)中的保護作用是通過激活AMPKα活化而發(fā)揮作用的,這為西
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