免疫抑制劑影響凋亡細(xì)胞免疫耐受誘導(dǎo)作用機制的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景: 器官移植是終末期器官功能衰竭的重要治療手段,移植排斥反應(yīng)是影響其預(yù)后的關(guān)鍵因素。理論上,誘導(dǎo)針對移植抗原的特異性免疫耐受是防治移植排斥反應(yīng)的最佳途徑,其優(yōu)點是:明顯提高移植術(shù)成功率;避免免疫抑制劑所致的毒副作用和繼發(fā)感染;降低醫(yī)療耗費。因此,誘導(dǎo)移植耐受成為移植免疫學(xué)研究的熱點。移植免疫耐受是機體免疫系統(tǒng)在接觸某種移植物后所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)不損害移植物。誘導(dǎo)移植免疫耐受的前提是:①使受者免疫系統(tǒng)接觸供者移植抗原;②對受者免疫系統(tǒng)進(jìn)

2、行調(diào)控,使其耐受供者抗原。目前誘導(dǎo)移植耐受的方法主要有:1)阻斷協(xié)同刺激信號通路;2)T細(xì)胞清除:即清除周圍和中樞淋巴組織的淋巴細(xì)胞;3)混合性嵌合體建立,等等。但是這些方法都有很大的局限性。本實驗室多年來一直研究凋亡細(xì)胞與免疫耐受,提出“供者凋亡細(xì)胞輸注誘導(dǎo)免疫耐受”理論。 細(xì)胞凋亡是一種基本生命現(xiàn)象,是細(xì)胞循自身程序結(jié)束其生命的主動死亡的過程。細(xì)胞凋亡廣泛參與機體病理生理過程,并在自身免疫病、病毒感染、腫瘤和肝臟免疫中起重要

3、作用。近10年來,凋亡細(xì)胞對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用受到高度關(guān)注?,F(xiàn)已證明,凋亡細(xì)胞可誘導(dǎo)移植免疫耐受,但其機制尚未完全闡明。目前推測以下機制起重要作用:1)抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cells,APC)可快速攝取凋亡細(xì)胞:巨噬細(xì)胞(Mφ)或樹突狀細(xì)胞(DC)表面表達(dá)某些特異性受體,可通過識別凋亡細(xì)胞所攜帶相應(yīng)抗原而快速攝取凋亡細(xì)胞。吞噬凋亡細(xì)胞后,吞噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號傳導(dǎo)通路被阻斷,抑制促炎因子的產(chǎn)生,同時阻斷

4、IL-12、Th17細(xì)胞相關(guān)因子IL-17、IL-23的釋放;2)APC可更有效地提呈凋亡細(xì)胞所攜帶的供者抗原:由于凋亡細(xì)胞表達(dá)特異性吞噬信號“eatmesignal”,使其所攜帶的供者抗原被特異性地濃集于受者APC內(nèi),因而能在短時間內(nèi)提供大量供者M(jìn)HC抗原,故能更有效地被受者APC提呈給T細(xì)胞;3)凋亡細(xì)胞抑制DC成熟。由于未成熟DC表面表達(dá)的分子如MHCⅠ、MHCⅡ、CD86及其它黏附分子水平低下,因而未成熟DC在向T細(xì)胞提呈抗原時

5、不能提供充分的共刺激信號,從而可以誘導(dǎo)免疫耐受;4)凋亡的中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞可能隔離趨化因子以阻止炎性細(xì)胞的募集;細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑、橋接凋亡細(xì)胞與吞噬細(xì)胞的可溶性因子、介導(dǎo)凋亡細(xì)胞被吞噬的配受體等都參與凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受的過程;5)局部微環(huán)境的作用:凋亡細(xì)胞被APC攝取后,可調(diào)節(jié)APC功能、促使APC分泌免疫抑制因子并誘生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。 機體通過多種復(fù)雜的調(diào)節(jié)機制維持免疫自穩(wěn),預(yù)防自身免疫的發(fā)生和調(diào)節(jié)病原體及環(huán)境因素引起的炎癥反

6、應(yīng)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)在不同的機制中起主要作用,是外周耐受主要的調(diào)節(jié)因素。CD4+CD25highT細(xì)胞亞群具有免疫調(diào)節(jié)功能,是機體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的主要類型。 最近幾年,關(guān)于Treg調(diào)節(jié)免疫抑制的作用分子和機制被廣泛研究,并取得了重要進(jìn)展。關(guān)于Treg的免疫調(diào)控機制主要有四種“作用方式”:抑制性因子的抑制作用;細(xì)胞溶解的抑制作用;代謝崩潰的抑制作用;通過調(diào)節(jié)DC成熟或功能的抑制作用。

7、 環(huán)孢霉素A(Cyclosporin A,CsA)和雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)是器官移植術(shù)后預(yù)防排斥反應(yīng)的常用藥。免疫抑制劑減少免疫細(xì)胞的增殖和活化,進(jìn)而抑制移植排斥反應(yīng),其分子機制是:CsA主要與嗜環(huán)蛋白(cyclophilin)形成復(fù)合物,抑制鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin)的活化,阻礙NFAT的去磷酸化與核轉(zhuǎn)位,從而阻斷IL-2的轉(zhuǎn)錄和T細(xì)胞的活化。Rapa則與FKBP12結(jié)合形成Rapa-FKBP12復(fù)合

8、物,后者作用于靶蛋白mTOR(mammalian target of rapamycin,mTOR),抑制mTOR的作用,阻斷T淋巴細(xì)胞從G1期到S期的進(jìn)程。應(yīng)用免疫抑制藥物可以有效地控制移植排斥反應(yīng),延長器官的存活時間。 免疫抑制劑已在臨床得到廣泛應(yīng)用,在探討輸注供者凋亡細(xì)胞而誘導(dǎo)移植耐受的臨床應(yīng)用前景時,須充分考慮免疫抑制劑對此干預(yù)策略的影響。闡明不同免疫抑制劑對凋亡細(xì)胞致耐受作用的影響具有重要意義,可為臨床實踐中聯(lián)合應(yīng)用免

9、疫抑制劑和輸注供者凋亡細(xì)胞聯(lián)合治療提供依據(jù)。所以,為初步探討常用免疫抑制劑是否能促進(jìn)凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生成的能力,并研究其可能機制。設(shè)計以下實驗研究內(nèi)容,包括三部分: 第一章、凋亡細(xì)胞輸注誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生。 目的:建立誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡的試驗方法,探討輸注凋亡細(xì)胞對體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用及可能機制。 方法:將雄性C57BL/6小鼠隨機分為對照組和實驗組,飼養(yǎng)在SPF級飼養(yǎng)柜中,飲用水和飼料均

10、經(jīng)滅菌處理。實驗組小鼠靜脈輸注1.0×108個/ml×200ul小鼠胸腺凋亡細(xì)胞;對照組小鼠輸注等體積的無菌PBS液。2周后戊巴比妥腹腔注射麻醉,無菌條件下經(jīng)眼球采集外周血,肝素抗凝,備用。分離脾臟和胸腺,用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,分別加入FITC-CD4單克隆抗體和PE-CD25單克隆抗體后,流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25highT細(xì)胞。 結(jié)果:輸注凋亡細(xì)胞后胸腺、脾臟和外周血中CD4+CD25highT在CD4+T

11、細(xì)胞的比率分別為0.650±0.073%、、4.340±0.338%,3.848±0.363%;而PBS對照組的比例為0.376±0.087%、3.426±0.100%、0.952±0.060%、2.762+0.186%,兩者之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論:凋亡細(xì)胞能誘導(dǎo)體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生成,從而可以誘導(dǎo)免疫耐受預(yù)防移植排斥的發(fā)生,為“凋亡細(xì)胞輸注誘導(dǎo)免疫耐受”這一理論提供實驗依據(jù)。 第二章、免疫抑制劑對

12、小鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響。 目的:探討免疫抑制劑環(huán)孢素A和雷帕霉素分別對小鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用及機制。 方法: (1)選擇雄性8周齡C57BL/6小鼠20只,隨機平均分為兩組。實驗組小鼠腹腔注射環(huán)孢素A20mg.kg-1.d-1×2周,對照組小鼠腹腔注射等體積的PBS×2周; (2)選擇雄性8周齡C57BL/6小鼠20只,隨機平均分為兩組。實驗組小鼠腹腔注射雷帕霉素1.5mg.kg-1.d-1×2周

13、,對照組小鼠腹腔注射等體積的PBS×2周; (3)2周后,各組小鼠在無菌條件下經(jīng)眼球采集外周血,并分離脾臟和胸腺,制備單細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞儀檢測調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞。 結(jié)果: 1.CsA處理的小鼠外周血、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞懸液中CD4+Foxp3+T淋巴細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞的比率分別為6.211±0.793%、11.200±0.513%和0.628±0.025%;而在PBS組小鼠外周血、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞中分別為1.86

14、0±0.805%、15.360±0.683%和2.122±0.107%,各組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。 2.Rapa處理組C57小鼠外周血、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞CD4+CD25highT細(xì)胞比率在CD4+T細(xì)胞的比率分別為6.280±0.275%、12.930±1.608%、9.880±0.484%,對照組C57小鼠外周血、脾細(xì)胞和胸腺內(nèi)分別為5.780±0.528%、7.720±0.921%、2.430±0.284%

15、,差異有顯著性(P<0.01)。Rapa顯著減少中樞淋巴器官和外周淋巴器官中CD4+T的數(shù)量,相對增加CD4+CD25highT細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的百分比。 結(jié)論: 1、CsA損害調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的發(fā)育,從而減少小鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的數(shù)量,從而降低免疫耐受的誘導(dǎo)作用; 2、Rapa不影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育,而是抑制其它CD4+T淋巴細(xì)胞亞型的發(fā)育,Rapa這種對CD4+CD25highT細(xì)胞和非CD4+C

16、D25highT細(xì)胞的不同作用將有利于移植患者誘導(dǎo)免疫耐受。 第三章、雷帕霉素對凋亡細(xì)胞輸注誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用及機制。 目的:探討免疫抑制劑雷帕霉素對凋亡細(xì)胞輸注誘導(dǎo)體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生成的作用及機制。 方法:將8周齡的雄性C57BL/6小鼠隨機平均分為3組:第一組為凋亡細(xì)胞處理組、第二組為雷帕霉素處理組、第三組為凋亡細(xì)胞與雷帕霉素聯(lián)合處理組。小鼠飼養(yǎng)在SPF級飼養(yǎng)柜中,飲用水和飼料均經(jīng)滅菌處理。第一組小鼠靜脈

17、輸注1.0×108/ml×200ul凋亡細(xì)胞;第二組小鼠腹腔注射雷帕霉素1.5mg.kg-1.d-1×2周;第三組給予靜脈輸注1.0×108/ml×200ul凋亡細(xì)胞,同時給予腹腔注射雷帕霉素1.5mg.kg-1.d-1×2周。2周后,用流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25highT細(xì)胞。 結(jié)果:經(jīng)凋亡細(xì)胞、雷帕霉素單獨處理和凋亡細(xì)胞與雷帕霉素聯(lián)合處理2周后,小鼠外周血CD4+CD25highT細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞的比率分別為:8.0

18、00±0.855%、5.540±0.235%、4.040±0.708%;脾臟細(xì)胞中分別為:4.320±0.338%、6.180±0.359%、8.380±0.557%;而胸腺分別為:0.650±0.073%、1.420±0.165%、2.120±0.215%,各組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論:雷帕霉素與凋亡細(xì)胞在誘導(dǎo)免疫耐受中可能存在協(xié)同作用,可在臨床實踐中聯(lián)合應(yīng)用雷帕霉素和輸注供者凋亡細(xì)胞有可能預(yù)防及治療移植排

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