蚓激酶的分離純化及其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞作用的研究.pdf

1、心腦血管疾病是現(xiàn)代社會(huì)嚴(yán)重危害人類身心健康和生命安全的多發(fā)病和常見病，發(fā)病率高，危害性大，死亡率已經(jīng)超過癌癥，成為人類的“第一健康殺手”。心腦血管疾病是心血管病和腦血管病的總稱，主要包括：高血壓、冠心病、腦出血、腦梗塞。目前，國(guó)際上冠狀動(dòng)脈支架的植入占全部冠心病介入治療的70％，植入支架后，可有效地解決冠狀動(dòng)脈的狹窄和閉塞，但隨之也帶來了許多弊端。由于異物的植入，容易引起排斥、過敏反應(yīng)，增強(qiáng)了感染的機(jī)會(huì)，最為嚴(yán)重的是支架的植入會(huì)引起血管

2、內(nèi)膜的損傷，使血小板凝聚，形成血栓，造成再狹窄。據(jù)報(bào)道冠脈內(nèi)支架放置術(shù)再狹窄率可達(dá)20％。因此，尋找到一種能有效預(yù)防再狹窄的藥物作為支架的涂層藥物是冠心病治療的重要任務(wù)。目前臨床上防止支架植入后血栓形成的主要方法是全身應(yīng)用抗凝/溶栓藥物治療，該類治療方法需較長(zhǎng)期用藥，易導(dǎo)致出血等并發(fā)癥，患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重。另一類方法就是在支架涂層抗凝藥物，如肝素，目前國(guó)外已有產(chǎn)品用于臨床，國(guó)內(nèi)未見研制該類產(chǎn)品報(bào)道。由于在分子或細(xì)胞水平上評(píng)價(jià)化合物的生物活性

3、,具有速度快，消耗量小，能在較短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)藥物的生物活性等特點(diǎn),本文通過蚓激酶對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用研究來評(píng)價(jià)是否能應(yīng)用于支架涂層藥物。 蚓激酶的藥理作用是多方面的，可以激活抗凝系統(tǒng)，溶解纖維蛋白，抑制血小板聚集，可以改善微循環(huán)；提高細(xì)胞t-pA含量。而對(duì)于蚓激酶對(duì)細(xì)胞作用的研究報(bào)道很少。因此，分離純化出蚓激酶,檢測(cè)蚓激酶對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用以及從細(xì)胞水平上探討其在細(xì)胞生長(zhǎng)增殖過程中的作用,這些均為蚓激酶能否作為支架涂層藥物來預(yù)防和治療I

4、SR提供了理論基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)用赤子愛勝蚯蚓為原料制備的粗酶粉作為上樣樣品，酶在pH4～11時(shí)是穩(wěn)定的，在不同的pH條件下使用離子交換是一條可行的道路。以粗酶粉為原料，經(jīng)過pH5.0時(shí)的DEAE-C層析、超濾、pH6.5時(shí)的DEAE-C層析后得到一種電泳純組分。并在洗脫的過程中對(duì)各個(gè)時(shí)間段收集的酶的活力以及蛋白含量進(jìn)行了跟蹤檢測(cè)。經(jīng)過兩次層析得到的電泳純品(100mmol/Lnacl-PBS洗脫峰)具有較高的比活,達(dá)到600IU/

5、mg以上，可以用于下一步試驗(yàn)。將該酶片斷簡(jiǎn)稱為EFE-a。將百奧蚓激酶膠囊簡(jiǎn)稱為EFE-b。在對(duì)酶的pH穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)EFE-a具有較好的pH穩(wěn)定性，在pH4～11，活力基本保持不變；在對(duì)酶的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)： EFE-a在20 OC～50 OC時(shí)活力基本保持不變,而在60 OC時(shí)活力稍有下降,大于70 OC時(shí)1個(gè)小時(shí)活力完全喪失。試驗(yàn)表明，該酶不是金屬酶,對(duì)體外血塊的溶解作用在同等條件下優(yōu)于尿激酶。在體外血小板聚集試驗(yàn)表明：9μg的EF

6、E-a與對(duì)照組相比，聚集抑制率可達(dá)76.15％。9μg、7.5μg、6μg、4.5μg, 、3μg的EFE-a與對(duì)照相比均具有顯著抑制血小板聚集的作用(P<0.01.) 。 在體外培養(yǎng)ECV304細(xì)胞的作用試驗(yàn)中，通過顯微鏡下觀察EFE-a和EFE-b對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過正常培養(yǎng)的細(xì)胞成多角形；經(jīng)EFE-a和EFE-b孵育24小時(shí)后的細(xì)胞均大部分變圓，置死；EFE-a對(duì)細(xì)胞的溶殺作用呈劑量依賴性；高劑量的EFE-a對(duì)細(xì)胞具