蚓激酶的分離純化及其對內(nèi)皮細(xì)胞作用的研究.pdf

1、心腦血管疾病是現(xiàn)代社會嚴(yán)重危害人類身心健康和生命安全的多發(fā)病和常見病，發(fā)病率高，危害性大，死亡率已經(jīng)超過癌癥，成為人類的“第一健康殺手”。心腦血管疾病是心血管病和腦血管病的總稱，主要包括：高血壓、冠心病、腦出血、腦梗塞。目前，國際上冠狀動脈支架的植入占全部冠心病介入治療的70％，植入支架后，可有效地解決冠狀動脈的狹窄和閉塞，但隨之也帶來了許多弊端。由于異物的植入，容易引起排斥、過敏反應(yīng)，增強了感染的機會，最為嚴(yán)重的是支架的植入會引起血管

2、內(nèi)膜的損傷，使血小板凝聚，形成血栓，造成再狹窄。據(jù)報道冠脈內(nèi)支架放置術(shù)再狹窄率可達(dá)20％。因此，尋找到一種能有效預(yù)防再狹窄的藥物作為支架的涂層藥物是冠心病治療的重要任務(wù)。目前臨床上防止支架植入后血栓形成的主要方法是全身應(yīng)用抗凝/溶栓藥物治療，該類治療方法需較長期用藥，易導(dǎo)致出血等并發(fā)癥，患者經(jīng)濟負(fù)擔(dān)重。另一類方法就是在支架涂層抗凝藥物，如肝素，目前國外已有產(chǎn)品用于臨床，國內(nèi)未見研制該類產(chǎn)品報道。由于在分子或細(xì)胞水平上評價化合物的生物活性

3、,具有速度快，消耗量小，能在較短時間內(nèi)檢測藥物的生物活性等特點,本文通過蚓激酶對內(nèi)皮細(xì)胞的作用研究來評價是否能應(yīng)用于支架涂層藥物。 蚓激酶的藥理作用是多方面的，可以激活抗凝系統(tǒng)，溶解纖維蛋白，抑制血小板聚集，可以改善微循環(huán)；提高細(xì)胞t-pA含量。而對于蚓激酶對細(xì)胞作用的研究報道很少。因此，分離純化出蚓激酶,檢測蚓激酶對內(nèi)皮細(xì)胞的作用以及從細(xì)胞水平上探討其在細(xì)胞生長增殖過程中的作用,這些均為蚓激酶能否作為支架涂層藥物來預(yù)防和治療I

4、SR提供了理論基礎(chǔ)。 本實驗用赤子愛勝蚯蚓為原料制備的粗酶粉作為上樣樣品，酶在pH4～11時是穩(wěn)定的，在不同的pH條件下使用離子交換是一條可行的道路。以粗酶粉為原料，經(jīng)過pH5.0時的DEAE-C層析、超濾、pH6.5時的DEAE-C層析后得到一種電泳純組分。并在洗脫的過程中對各個時間段收集的酶的活力以及蛋白含量進行了跟蹤檢測。經(jīng)過兩次層析得到的電泳純品(100mmol/Lnacl-PBS洗脫峰)具有較高的比活,達(dá)到600IU/

5、mg以上，可以用于下一步試驗。將該酶片斷簡稱為EFE-a。將百奧蚓激酶膠囊簡稱為EFE-b。在對酶的pH穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)EFE-a具有較好的pH穩(wěn)定性，在pH4～11，活力基本保持不變；在對酶的熱穩(wěn)定性試驗中發(fā)現(xiàn)： EFE-a在20 OC～50 OC時活力基本保持不變,而在60 OC時活力稍有下降,大于70 OC時1個小時活力完全喪失。試驗表明，該酶不是金屬酶,對體外血塊的溶解作用在同等條件下優(yōu)于尿激酶。在體外血小板聚集試驗表明：9μg的EF

6、E-a與對照組相比，聚集抑制率可達(dá)76.15％。9μg、7.5μg、6μg、4.5μg, 、3μg的EFE-a與對照相比均具有顯著抑制血小板聚集的作用(P<0.01.) 。 在體外培養(yǎng)ECV304細(xì)胞的作用試驗中，通過顯微鏡下觀察EFE-a和EFE-b對內(nèi)皮細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過正常培養(yǎng)的細(xì)胞成多角形；經(jīng)EFE-a和EFE-b孵育24小時后的細(xì)胞均大部分變圓，置死；EFE-a對細(xì)胞的溶殺作用呈劑量依賴性；高劑量的EFE-a對細(xì)胞具