乙醇對內(nèi)皮細胞黏著斑激酶的影響及其細胞毒性作用.pdf

1、我國酒文化源遠流長，但隨著飲酒在社會交往活動中更加頻繁，飲酒所帶來的社會問題也日益凸顯。近年來飲酒后傷害案件屢見不鮮，加之案情復雜，給檢案人員造成很大壓力。早在1963年有國外法醫(yī)提出外傷性蛛網(wǎng)膜下腔出血(traumatic subarachnoid hemorrhage，tSAH)與酗酒有關(guān)，實際檢案過程發(fā)現(xiàn)酒后受到輕微外力作用，顱內(nèi)出血的發(fā)病率和死亡率明顯增高。雖然已知飲酒可以調(diào)節(jié)心率和局部血流，改變血管通透性，影響血管舒縮功能，破

2、壞凝血、抗凝血平衡，但這些改變尚不足以解釋飲酒后外力作用易于引發(fā)顱內(nèi)出血的原因。此外，長期困擾法醫(yī)工作者的難題是:如何界定飲酒和外力各自的參與度，進而判定案件性質(zhì)。所以更深入地研究飲酒易于造成腦血管破裂出血機制，有助于指導法醫(yī)實踐、改進檢案思路和明確判定結(jié)果。
　　乙醇(ethanol，EtOH)又名酒精，是酒類飲品中的主要成分。飲酒后乙醇可以以原型形式進入血液，血乙醇濃度(blood alcohol concentration，

3、BAC)快速升高，乙醇隨血流遍布全身。內(nèi)皮細胞(endotheilial cell，EC)位于血管腔面最內(nèi)側(cè)，直接接觸血液中乙醇及其代謝產(chǎn)物;另一方面內(nèi)皮細胞生物功能活躍，擁有乙醇代謝相關(guān)酶體參與乙醇代謝，這就決定了內(nèi)皮細胞可能遭受乙醇的直接和間接毒性作用，成為乙醇首當其沖的損傷靶點。
　　由于血管內(nèi)皮承擔著重要的血管調(diào)節(jié)功能，在物質(zhì)交換、血管張力調(diào)控、凝血、血管發(fā)生、白細胞游走等多種生物過程中發(fā)揮不可替代的作用;并可以“感知”血

4、流切應力、周期應力等各種機械應力及各種血液成分改變，協(xié)調(diào)其他細胞共同作出相應反應，所以乙醇引起的內(nèi)皮細胞損傷會危及到整個血管系統(tǒng)。
　　其中腦血管具有其他部位血管不可比擬的自主調(diào)控能力以保持穩(wěn)定的腦灌流量，對內(nèi)皮細胞損傷愈發(fā)敏感。本課題以內(nèi)皮細胞作為主要研究對象，探索乙醇的血管毒性作用，為進一步研究飲酒后輕微外力引發(fā)蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)的機制做好鋪墊。
　　血管內(nèi)皮以單層細

5、胞形式分布，其結(jié)構(gòu)、功能完整性特別依賴于與細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的連接、交流。黏著斑復合體是細胞與ECM連接處的復合結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了細胞骨架與ECM的連接。一方面它可以將細胞外的信號傳入胞內(nèi)，通過“引導”應力纖維分布實現(xiàn)對細胞形態(tài)、功能的調(diào)整;另一方面將細胞生命活動產(chǎn)生的細胞內(nèi)牽引力(tractionforce)傳遞到ECM，進而轉(zhuǎn)化為生物信號傳遞給周圍細胞，使機體能作出及時的宏觀調(diào)整。
　　黏

6、著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是黏著斑復合體重要的組成成分。一方面FAK受到integrin聚集、生長因子受體連接、切應力等多種因素調(diào)節(jié)活化;另一方面FAK可以連接并激活其他黏著斑結(jié)構(gòu)蛋白，參與黏著斑復合體形成與成熟，調(diào)節(jié)細胞粘附、遷移等基本功能，還可以招募多種功能蛋白，參加到不同的信號通路調(diào)節(jié)中去。現(xiàn)已證實FAK在內(nèi)皮細胞中發(fā)揮著舉足輕重的作用。用特異失活內(nèi)皮細胞內(nèi)FAK的方法研究胚胎發(fā)育，發(fā)現(xiàn)FAK失

7、活的胚胎雖然早期發(fā)育正常，但是在胚胎發(fā)育晚期出現(xiàn)胚胎、卵黃囊和胎盤的血管發(fā)育異常，內(nèi)皮細胞死亡增多，血管破裂進而出現(xiàn)出血、水腫。多種疾病中也發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞FAK表達、活化異常。對于過量乙醇刺激對內(nèi)皮細胞FAK的影響及相應的生物學意義尚缺乏研究。本研究將著眼于過量乙醇對內(nèi)皮細胞FAK的影響，探討乙醇血管毒性的相關(guān)機制。
　　第一部分、乙醇對內(nèi)皮細胞的毒性作用
　　目的:本部分將從動物整體水平和體外細胞水平觀察乙醇對血管的毒性作用

8、，全面研究乙醇對內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)和功能的影響。
　　方法:
　　1.采用灌胃器給酒制備大鼠飲酒模型，檢測飲酒后BAC變化。運用Masson三色染色和透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)技術(shù)觀察不同飲酒時間大鼠腦實質(zhì)毛細血管和基底動脈形態(tài)改變;
　　2.給予人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)不同濃度、

9、不同時間的乙醇刺激，利用MTT檢測HUVEC存活率，反映乙醇的細胞毒性;
　　3.利用流式細胞術(shù)觀測乙醇誘導的HUVCE凋亡;
　　4.用光鏡、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)和TEM觀察乙醇引起的內(nèi)皮細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變;
　　5.待乙醇干預結(jié)束后用胰酶替代物消化HUVEC，重新接種于纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）包被的培養(yǎng)板中，測量1-2h內(nèi)的粘附率和粘附

10、過程中細胞鋪展的面積以評價內(nèi)皮細胞粘附能力;利用特異阻斷抗體預處理細胞實現(xiàn)整合素（integrin）阻斷后，進行粘附實驗，觀察integrin在其中作用;
　　6.給予乙醇干預后，利用劃痕實驗檢驗乙醇對HUVEC遷移能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1.短期飲酒大鼠腦內(nèi)既可見明顯血管源性水腫，毛細血管周圍間隙明顯增大，內(nèi)皮細胞微絨毛減少，胞質(zhì)內(nèi)線粒體空泡化;
　　2.長期飲酒大鼠基底動脈中膜平滑肌成分與外膜膠原成分增

11、多，壁/腔比明顯增大(p＜0.05)，并可見內(nèi)皮細胞脫落;
　　3.乙醇使內(nèi)皮細胞生存率呈劑量、時間依賴性下降，與對照組相比出現(xiàn)較多早期凋亡細胞(p＜0.05)，這些凋亡細胞在TEM下呈現(xiàn)出細胞核形態(tài)不規(guī)則，核染色質(zhì)邊集呈半月狀且電子密度增高，細胞胞漿減少等征象;
　　4.光鏡、SEM、TEM觀察可見乙醇刺激使HUVEC失去正常形態(tài)，胞內(nèi)細胞器表現(xiàn)出空泡化等損傷征象;
　　5.乙醇明顯降低HUVEC粘附率(p＜0.05

12、)和平均細胞鋪展面積(p＜0.05)。特異integrinβ1抗體預處理后可以降低正常組細胞粘附率，但對乙醇組影響不明顯;
　　6.乙醇明顯降低HUVEC單細胞層劃痕的愈合速度(p＜0.05)。
　　小結(jié):在體和細胞實驗均證明過量乙醇具有明顯的內(nèi)皮毒性作用，影響內(nèi)皮細胞形態(tài)、降低生存率、抑制其與ECM粘附及粘附后鋪展，以及降低內(nèi)皮細胞遷移能力;乙醇作用后HUVEC粘附力下降可能與integrin信號通路有關(guān)。
　　第二

13、部分、過量乙醇對內(nèi)皮細胞黏著斑激酶的影響及其產(chǎn)生機制
　　目的:本部分將系統(tǒng)研究過量乙醇對內(nèi)皮細胞中FAK分布、蛋白表達及磷酸化的影響，并探討相關(guān)機制。
　　方法:
　　1.用細胞免疫熒光標記細胞粘附、鋪展和遷移過程中的磷酸化的FAK酪氨酸397位點(phosphorylated FAK at Tyr397，pFAK Y397)，觀察黏著斑復合體分布變化;
　　2.利用western blot檢測乙醇作用對FAK

14、總蛋白水平和磷酸化水平的影響;
　　3.給予HUVEC特異乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)抑制劑4-甲基吡唑(4-methyle-pyrazole，4MP)預孵或給予乙醇主要的代謝產(chǎn)物乙醛(acetaldehyde，Ach)刺激，研究乙醇代謝在FAK變化中的作用;
　　4.利用活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)特異探針DCFH-DA標記ROS觀察乙醇、乙醛引起的

15、氧化應激變化;
　　5.給予外源性過氧化氫(H2O2)或非特異性內(nèi)源性ROS清除劑N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)，研究氧化應激在FAK變化中的作用。
　　結(jié)果:
　　1.乙醇并未影響integrinβ1的表達和分布;
　　2.在鋪展過程中的對照組細胞內(nèi)pFAK Y397形成較大的片狀分布，尤以細胞邊緣明顯，遷移過程中細胞遷移方向的前緣亦可形成大片狀pFAK Y397表達;

16、而過量乙醇干預過的HUVEC中形成的片狀結(jié)構(gòu)小而少;
　　3.乙醇增加FAK磷酸化，且呈劑量、時間依賴性(p＜0.05，p＜0.01)，但并不影響FAK總蛋白水平;
　　4.給予4MP可以削弱過量乙醇引起的FAK磷酸化增高(p＜0.05);給予乙醛增加pFAK Y397(p＜0.01);
　　5.乙醇、乙醛刺激均可激發(fā)內(nèi)皮細胞中ROS產(chǎn)生;
　　6.給予外源性H2O2可以激發(fā)FAK磷酸化(p＜0.01);給予NA

17、C可部分降低乙醇、乙醛引起的FAK磷酸化水平(p＜0.05)。
　　小結(jié):過量乙醇一方面干擾了FAK參與的內(nèi)皮細胞黏著斑成熟，不能有效“引導”F-actin骨架，導致內(nèi)皮細胞生存、粘附、遷移功能受損;另一方面增加pFAK水平，且乙醇和（或）其代謝產(chǎn)生的乙醛、氧化應激是引起FAK酪氨酸磷酸化的重要因素之一;過量乙醇并不影響FAK總蛋白水平。
　　第三部分、黏著斑激酶磷酸化在過量乙醇引起的內(nèi)皮細胞毒性中的作用
　　目的:本

18、部分實驗將以PI3K/AKT信號通路著手研究過量乙醇干預后FAK磷酸化增高在內(nèi)皮細胞一氧化氮(nitric oxide，NO)內(nèi)穩(wěn)態(tài)破壞中的作用。
　　方法:
　　1.利用NO特異探針DAF-FM檢測內(nèi)皮細胞NO產(chǎn)生，并利用eNOS特異抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽（ω-nitro-L-argine methyl ester，L-NAME）、iNOS特異抑制劑L-canavanine和FAK自主磷酸化抑制劑PF5732

19、28(PF228)研究NO來源;
　　2.在給予HUVEC乙醇刺激前給予PI3K/AKT通路抑制劑wortmannin和PF228預處理研究eNOS活化的相關(guān)通路;
　　3.用western blot檢測硝基酪氨酸(nitrotyrosine，NT)產(chǎn)生量。
　　結(jié)果:
　　1.乙醇引起NO明顯增高(p＜0.05);L-NAME或PF228可以減弱乙醇引起的NO增加(p＜0.05)，而L-canavanine作用

20、不明顯;
　　2.給予wortmannin和PF228均可明顯減弱乙醇引起AKT和eNOS磷酸化(p＜0.05);
　　3.200mM乙醇干預24h后明顯增加內(nèi)皮細胞NT生成量(p＜0.05)。
　　小結(jié):過量乙醇刺激引起的FAK磷酸化通過PI3K/AKT通路促進的eNOS活化，產(chǎn)生過量NO，生成具有細胞毒性的NT，造成內(nèi)皮細胞損傷。
　　結(jié)論:
　　過量乙醇可以引起腦血管內(nèi)皮細胞損傷，其機制主要表現(xiàn)在兩個