乙醇對內(nèi)皮細胞凋亡的影響及其作用機制;大鼠體內(nèi)甲基蓮心堿濃度測定的HPLC方法學建立.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：乙醇對內(nèi)皮細胞凋亡的影響及機制
　　 酒精對健康的影響目前尚存在爭議，但長期大量飲酒危害健康卻不容質(zhì)疑，可導致高血壓，動脈粥樣硬化,心律失常，腦血管意外等。研究表明內(nèi)皮細胞凋亡與許多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關。以AS 為例，在粥樣斑塊的發(fā)展過程中凋亡事件發(fā)生率升高，另一方面內(nèi)皮凋亡的增加也能夠引發(fā)AS。
　　 乙醇的細胞損傷作用，目前大致有直接損傷和氧化損傷兩種，就體內(nèi)所能達

2、到濃度而言，長期大量飲酒造成的細胞損傷作用很大程度上可能與氧化應激有關。探討乙醇與內(nèi)皮細胞凋亡的關系、闡明其作用機制，對于深入認識及防治乙醇對心血管系統(tǒng)的損傷具有一定意義。
　　 本研究選取人內(nèi)皮細胞為研究對象，著重觀察乙醇對內(nèi)皮細胞凋亡的影響并探討其作用機制。
　　 （一）乙醇對內(nèi)皮細胞凋亡的影響
　　 目的：觀察乙醇對EA.hy926細胞增殖活力及乙醇對內(nèi)皮細胞凋亡形態(tài)學及細胞凋亡率的影響。
　　 方

3、法：體外培養(yǎng)EA.hy926，以0.3%，0.6%，1.0%(v/v)乙醇分別孵育細胞至 6，9，12 h，采用四甲基偶氮唑藍（3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑，0.5 mg/mL）
　　 法檢測細胞生長抑制率﹑臺盼藍拒染法檢測細胞存活率。0.6%乙醇孵育人內(nèi)皮細胞EA.hy926 至12h，Hoechst 33258熒光染料染色觀察細胞發(fā)生的凋亡形態(tài)學改變。另設陰性對照組，實驗組（0.6% 乙醇），聯(lián)用

4、N-乙酰半胱氨酸組（0.6% 乙醇+10 mmol/LNAC)，單用NAC組（10 mmol/L NAC），各組藥物均孵育至12h，采用改良Sub-G1法檢測細胞凋亡率的變化。
　　 結(jié)果：乙醇（0.3%，0.6%，1.0%）明顯抑制內(nèi)皮細胞生長。乙醇作用內(nèi)皮細胞6h，隨濃度增高，其對細胞生長的抑制率分別為（29.38±1.69）%，（35.98±2.23）%，（40.75±0.55）%；相應地細胞存活率分別為（78.09±9.

5、81）%，（73.60±8.34）%，（69.03±11.56）%。乙醇作用內(nèi)皮細胞9h，隨濃度增高,其對細胞生長的抑制率分別為（12.58±1.44）%，（18.39±3.26）%，（28.62±1.13）%；相應地細胞存活率分別為（85.42±10.97）%，（77.58±5.01）%，（71.85±14.06）%。乙醇作用內(nèi)皮細胞12h，隨濃度增高，其對細胞生長的抑制率分別為（7.57±1.17）%，（10.96±1.28）%，（

6、13.81±0.83）%；相應地細胞存活率分別為（94.72±5.65）%，（89.46±3.67）%，（84.31±9.77）%。0.6%乙醇孵育EA.hy926后，于熒光顯微鏡鏡下觀察，出現(xiàn)大量凋亡細胞，其細胞核呈致密濃染。細胞凋亡率也從對照組的(0.49±0.16)% 明顯上升至 (5.31±0.54)%(P﹤0.01)，而聯(lián)用NAC組細胞凋亡率降低至(1.28±0.24）%，較實驗組顯著降低(P ﹤ 0.01)。
　　

7、結(jié)論：乙醇（0.3%，0.6%，1.0%）抑制人內(nèi)皮細胞EA.hy926 生長，在相同作用時間下，隨乙醇濃度的增加該抑制作用增強。0.6%乙醇能夠誘導內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡，NAC則能減少乙醇誘導的凋亡。
　　 （二）乙醇誘導內(nèi)皮細胞凋亡的作用機制
　　 目的：觀察乙醇對EA.hy926細胞SOD活力，MDA含量，細胞活性氧（ROS）水平及細胞游離鈣離子濃度（[Ca2+]I）的影響。
　　 方法：實驗分陰性對照組，實驗

8、組（0.6% 乙醇），聯(lián)用NAC組（0.6% 乙醇+10mmol/L NAC)，單用NAC組（10 mmol/L NAC），各組藥物均孵育至12h。取細胞超聲裂解液，檢測細胞SOD活力和MDA含量。另取各組細胞，采用熒光探針DCFH-DA檢測細胞ROS 及熒光染料Fura-2/AM檢測內(nèi)皮細胞[Ca2+]I。
　　 結(jié)果：與陰性對照組比，實驗組SOD活力由40.8±2.9 U/mg protein 顯著降低到29.2±4.0 U

9、/mg protein、MDA含量由46.5±3.8 nmol/mg protein 升高到89.5±5.6 nmol/mgprotein、ROS熒光強度從93.69±7.58 升高到162.30±18.85 (P ﹤ 0.01)；而聯(lián)用NAC組較實驗組，MDA含量顯著降低至45.4±3.3 nmol/mg protein、SOD活力增加至37.9±3.0U/mg protein、ROS熒光強度降低為114.35±9.63 (P ﹤ 0

10、.01)。0.6%乙醇處理12 小時后，胞內(nèi)[Ca2+]I 為(183.8±19.9)nmol/L，與對照組(149.0±18.0）nmol/L 相比，明顯升高(P ﹤ 0.05)；使用抗氧化劑NAC后，胞內(nèi)[Ca2+]I 明顯降低至(158.2±8.6)nmol/L。
　　 結(jié)論: 0.6%乙醇處理EA.hy926后，細胞ROS 水平、MDA含量和細胞內(nèi)[Ca2+]I均顯著升高，而SOD活力明顯降低。而NAC可以減輕乙醇引起的

11、上述效應。
　　 第二部分：大鼠體內(nèi)甲基蓮心堿濃度測定的方法學建立
　　 目的：建立大鼠血漿和肝臟勻漿中甲基蓮心堿濃度測定的高效液相色譜法。
　　 方法：大鼠血漿和肝臟勻漿樣品經(jīng)乙醚萃取，進樣分析。采用Hypersil BDS C18（5μm，4.0 mm×250 mm)柱分離，柱溫: 25 ℃。流動相：甲醇︰0.2 M KH2PO4 ︰0.2 M NaOH︰三乙胺 (71 ︰17 ︰12 ︰0.002 v/v/

12、v/v)，pH 9.2～9.3，0.45 μm 減壓抽濾，超聲脫氣5 min，流速0.8 ml/min；進樣量：20 μL；紫外檢測波長：282 nm。
　　 結(jié)果：血漿中甲基蓮心堿的線性范圍為0.03125～2.00 μg/mL；日內(nèi)和日間精密度(RSD)分別為小于8.0%和5.0%，絕對回收率為80.4%～89.2%。其在肝臟勻漿中的線性范圍為0.0625～16.0 μg/mL，日內(nèi)和日間RSD 均小于3.0%，絕對回收率為