小檗堿和甲基蓮心堿對(duì)人成骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、成骨肉瘤是惡性骨腫瘤中最常見(jiàn)的一種，發(fā)病年齡多在10-25歲，嚴(yán)重威脅兒童和青少年的健康。成骨肉瘤對(duì)放射治療不敏感，主要采取手術(shù)聯(lián)合化療的手段進(jìn)行治療，但是目前使用的腫瘤化療藥物存在副作用大和腫瘤細(xì)胞易產(chǎn)生耐藥性等缺陷，因而從天然化合物中尋找低毒、高效的抗癌藥物對(duì)于成骨肉瘤的治療有重要意義。 為深入研究小檗堿及甲基蓮心堿的抗腫瘤作用及其分子機(jī)制，本課題進(jìn)行了以下四個(gè)方面的工作： 第一部分小檗堿和甲基蓮心堿對(duì)成骨肉瘤細(xì)胞和正

2、常成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 為了檢測(cè)小檗堿及甲基蓮心堿對(duì)成骨肉瘤細(xì)胞和正常成骨細(xì)胞的抑制作用，我們選用了人成骨肉瘤細(xì)胞U20S、Saos-2、HOS和正常成骨細(xì)胞HCO進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、四唑鹽比色法、BrdU摻入法分析小檗堿及甲基蓮心堿對(duì)成骨肉瘤細(xì)胞及正常成骨細(xì)胞的抑制作用。 1、形態(tài)學(xué)觀察和MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)： （1）小檗堿及甲基蓮心堿對(duì)人成骨肉瘤細(xì)胞U20S具有明顯的抑制作用并呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。

3、 （2）對(duì)比分析小檗堿和甲基蓮心堿對(duì)U20S的抑制作用發(fā)現(xiàn)，甲基蓮心堿具有更顯著的抑制作用，如藥物處理24h后分析，4μmol/L甲基蓮心堿處理的細(xì)胞存活率為50.6％，而135μmol/L小檗堿處理的細(xì)胞存活率為75.7％。 2、采用BrdU摻入法檢測(cè)小檗堿處理后U20S細(xì)胞的增殖情況發(fā)現(xiàn)，U20S細(xì)胞中處于增殖期的細(xì)胞數(shù)目隨藥物濃度的升高而逐漸減少，與對(duì)照細(xì)胞相比有顯著差異。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了小檗堿對(duì)U20S細(xì)胞的抑制

4、作用。 3、MTT法檢測(cè)小檗堿及甲基蓮心堿對(duì)人成骨肉瘤細(xì)胞Saos-2、HOS和正常成骨細(xì)胞HCO生長(zhǎng)的抑制作用時(shí)發(fā)現(xiàn)： （1）小檗堿及甲基蓮心堿對(duì)成骨肉瘤細(xì)胞均有抑制作用并呈明顯的劑量依賴性和時(shí)間依賴性。 （2）小檗堿及甲基蓮心堿對(duì)正常成骨細(xì)胞HCO的毒性明顯低于腫瘤細(xì)胞，低濃度的甲基蓮心堿對(duì)正常成骨細(xì)胞不僅沒(méi)有抑制作用，而且能促進(jìn)正常成骨細(xì)胞的存活。 以上結(jié)果表明小檗堿及甲基蓮心堿對(duì)成骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)

5、具有明顯的抑制作用：而且對(duì)多種成骨肉瘤細(xì)胞均有抑制作用，具有普遍性；更重要的是兩種生物堿對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較好的殺傷作用，而對(duì)正常細(xì)胞毒性較小。因此深入研究?jī)煞N藥物的抗腫瘤機(jī)制具有重要意義。 第二部分小檗堿和甲基蓮心堿對(duì)成骨肉瘤細(xì)胞和正常成骨細(xì)胞細(xì)胞周期的影響及其作用機(jī)制 導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯是抗腫瘤藥物抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的重要機(jī)制之一。因此，我們采用流式細(xì)胞儀、Real-time PCR及Western Blotting等方法研

6、究小檗堿和甲基蓮心堿對(duì)成骨肉瘤細(xì)胞細(xì)胞周期的影響及其作用機(jī)制。 1、PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)： （1）U2OS和正常成骨細(xì)胞HCO經(jīng)小檗堿處理后G1期細(xì)胞隨藥物濃度升高而逐漸增多，S期細(xì)胞隨藥物濃度升高而逐漸減少，小檗堿使U2OS和HCO細(xì)胞停滯于G1期，研究結(jié)果還顯示50μg/ml的小檗堿使U2OS細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期的累積；Saos-2細(xì)胞經(jīng)小檗堿處理后G1期和S期細(xì)胞沒(méi)有規(guī)律性變化，G2/M期細(xì)胞隨藥物濃度

7、升高而逐漸增多，小檗堿使Saos-2停滯于G2/M期。 （2）U2OS和Saos-2細(xì)胞經(jīng)甲基蓮心堿處理后G1期細(xì)胞隨藥物濃度升高而逐漸增多，S期細(xì)胞隨藥物濃度升高而逐漸減少，甲基蓮心堿處理后使U2OS和Saos-2細(xì)胞停滯于G1期。 2、Western Blotting和Real-time PCR方法檢測(cè)兩種藥物處理后p53基因及與G1期停滯相關(guān)蛋白的變化發(fā)現(xiàn)： （1）小檗堿處理下調(diào)U2OS細(xì)胞cyclin D

8、1、cyclin E的表達(dá)，而上調(diào)p53、p21和p27的表達(dá)；小檗堿可以從mRNA和蛋白質(zhì)兩個(gè)水平來(lái)激活p53。 （2）甲基蓮心堿引起U2OS細(xì)胞G1期停滯是通過(guò)上調(diào)p21的表達(dá)而下調(diào)Cyclin E的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，cyclin D1和p53的表達(dá)沒(méi)有規(guī)律性改變。 3、降低U2OS細(xì)胞p53蛋白活性對(duì)小檗堿引起U2OS細(xì)胞G1期停滯的影響 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p53突變載體降低U2OS細(xì)胞內(nèi)源性p53蛋白的活性，并用流式細(xì)胞

9、儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞隨藥物濃度升高G1期細(xì)胞逐漸增多，S期細(xì)胞逐漸減少；轉(zhuǎn)染mtp53載體的細(xì)胞，G1期細(xì)胞逐漸增多、S期細(xì)胞逐漸減少的趨勢(shì)被明顯削弱。 以上結(jié)果顯示，小檗堿誘導(dǎo)U2OS細(xì)胞G1期停滯并下調(diào)cyclin D1、cyclin E的表達(dá)，而上調(diào)p53、p21和p27的表達(dá)；小檗堿可以從mRNA和蛋白質(zhì)兩個(gè)水平來(lái)激活p53。p53參與了小檗堿引起的成骨肉瘤細(xì)胞的G1期停滯，G2/M期的停滯與p53無(wú)

10、關(guān)。甲基蓮心堿引起成骨肉瘤細(xì)胞G1期停滯是通過(guò)上調(diào)p21的表達(dá)而下調(diào)CyclinE的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，與p53無(wú)關(guān)。 第三部分小檗堿和甲基蓮心堿對(duì)成骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響 化療藥物抗腫瘤的另一重要機(jī)制是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，本部分采用AnnexinⅤ-PI雙染法、TUNEL法檢測(cè)了小檗堿及甲基蓮心堿處理后成骨肉瘤細(xì)胞的凋亡情況；并用Real-time PCR法檢測(cè)了U2OS-neo和U2OS-mtp53細(xì)胞經(jīng)小檗堿處理后p5

11、3下游與凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況。 1、形態(tài)學(xué)觀察及TUNEL法檢測(cè)小檗堿對(duì)成骨肉瘤細(xì)胞及正常成骨細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示小檗堿能夠誘導(dǎo)成骨肉瘤細(xì)胞和正常成骨細(xì)胞發(fā)生凋亡；凋亡率隨小檗堿濃度的升高而增加；相同濃度的小檗堿處理后正常細(xì)胞的凋亡率低于腫瘤細(xì)胞，p53缺陷細(xì)胞Saos-2在低濃度時(shí)凋亡率與正常細(xì)胞沒(méi)有顯著差異。 2、TUNEL法檢測(cè)小檗堿處理U2OS-mtp53和U2OS-neo細(xì)胞的凋亡。小檗堿可以誘導(dǎo)U2OS

12、-mtp53細(xì)胞及U2OS-neo細(xì)胞凋亡，U2OS-mtp53細(xì)胞的凋亡率明顯低于同樣濃度小檗堿處理的U2OS-neo細(xì)胞。該結(jié)果初步說(shuō)明p53參與小檗堿引起的U2OS細(xì)胞凋亡。 3、Real-time PCR檢測(cè)p53下游凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。為了進(jìn)一步證明p53參與了小檗堿引起的U2OS細(xì)胞凋亡，我們用小檗堿處理U2OS-mtp53和U2OS-neo細(xì)胞，檢測(cè)p53下游與凋亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平。U2OS-neo細(xì)胞經(jīng)

13、小檗堿處理后，p53下游與凋亡相關(guān)的基因BAX、PUMA和FAS的mRNA表達(dá)顯著上升，并呈劑量依賴性；U2OS-mtp53細(xì)胞經(jīng)小檗堿處理后，BAX、PUMA和FAS的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。該結(jié)果進(jìn)一步證明p53參與小檗堿引起的U2OS細(xì)胞凋亡。 4、AnnexinⅤ-PI雙染法檢測(cè)甲基蓮心堿對(duì)U2OS細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示甲基蓮心堿處理后細(xì)胞的凋亡率與對(duì)照組細(xì)胞相比沒(méi)有明顯差別，說(shuō)明甲基蓮心堿對(duì)U2OS細(xì)胞凋亡沒(méi)有

14、明顯誘導(dǎo)作用。 以上結(jié)果表明小檗堿誘導(dǎo)成骨肉瘤細(xì)胞和正常成骨細(xì)胞凋亡，相同濃度的小檗堿引起正常細(xì)胞凋亡率低于腫瘤細(xì)胞。p53通過(guò)激活下游與凋亡相關(guān)基因BAX、PUMA和FAS的表達(dá)而參與小檗堿誘導(dǎo)的U2OS細(xì)胞凋亡。誘導(dǎo)凋亡不是甲基蓮心堿抑制成骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制。 第四部分初步探討小檗堿引起腫瘤細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡的上游因素 前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，p53在小檗堿抑制成骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，參與了小檗

15、堿引起的細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡。小檗堿升高p53的磷酸化水平并上調(diào)p53 mRNA表達(dá)水平。那么p53又是怎樣被激活的？我們推測(cè)DNA損傷可能是小檗堿激活p53并引起細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡的上游因素。本部分采用免疫熒光結(jié)合Western Blotting方法檢測(cè)小檗堿處理U2OS細(xì)胞后γ-H2AX的累積：并用微核率檢測(cè)U2OS細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定性。結(jié)果如下： 1、免疫熒光和Western Blotting檢測(cè)小檗堿處理U2OS細(xì)

16、胞后γ-H2AX的累積。免疫熒光結(jié)果顯示小檗堿可以導(dǎo)致γ-H2AX在細(xì)胞內(nèi)累積，隨藥物濃度的升高γ-H2AX陽(yáng)性細(xì)胞增多，焦點(diǎn)更多更亮。Western Blotting結(jié)果顯示，隨小檗堿濃度的升高，磷酸化H2AX的表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)。 2、相同濃度的小檗堿引起正常成骨細(xì)胞HCO中γ-H2AX累積要低于U2OS細(xì)胞。相同濃度的小檗堿處理后在U2OS細(xì)胞中的熒光累積要比HCO細(xì)胞強(qiáng)，說(shuō)明與HCO細(xì)胞相比小檗堿更容易進(jìn)入U(xiǎn)2OS細(xì)胞。

17、 3、微核計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，小檗堿處理后隨藥物濃度的升高，U2OS細(xì)胞微核率與對(duì)照細(xì)胞相比有顯著上升趨勢(shì)。 4、免疫熒光檢測(cè)甲基蓮心堿處理U2OS細(xì)胞γ-H2AX的累積。甲基蓮心堿處理U2OS細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)典型的γ-H2AX焦點(diǎn)出現(xiàn)，說(shuō)明甲基蓮心堿不能導(dǎo)致γ-H2AX在細(xì)胞內(nèi)的累積。 以上結(jié)果表明，小檗堿處理U2OS細(xì)胞引起γ-H2AX的累積和微核率的上升，說(shuō)明導(dǎo)致DNA損傷是小檗堿激活成骨肉細(xì)胞p53并引起細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞