小檗堿對人食管鱗癌細胞的放射增敏作用及其機制研究.pdf

1、[研究背景]食管癌是常見的惡性腫瘤,以其高發(fā)病率和不良預后嚴重威脅著人類身體健康。在我國,食管癌的發(fā)病率逐年升高,死亡率僅次于胃癌,不僅危害人類健康也給患者家庭和社會造成沉重的醫(yī)療負擔。放射治療作為腫瘤治療的三大主要手段之一,可以明顯緩解患者的癥狀,改善患者生命質(zhì)量。但是腫瘤復發(fā)、放射抗拒和嚴重的副作用等問題極大地限制了放射的治療效果和臨床應用。因此降低腫瘤對放射的耐受,增強腫瘤的放射敏感性,減輕放射的副作用是現(xiàn)在醫(yī)學亟待解決的問題。<

2、br>　　 小檗堿又稱黃連素,是從毛莨科黃連屬植物黃連、黃柏的根莖中提取的異喹啉類生物堿。研究證明,小檗堿具有細胞毒性,可以通過抑制蛋白合成,阻滯細胞周期,促進細胞凋亡等多種途徑對多種腫瘤細胞(如膠質(zhì)母細胞瘤、肝癌、胃癌、前列腺癌、骨肉瘤等)產(chǎn)生抑制作用。最近研究指出,小檗堿的腫瘤抑制作用也與其抑制IKK的磷酸化和P65的轉(zhuǎn)錄,進而抑制NF—kB的組成型激活有關(guān)。除了直接的腫瘤殺傷作用外,也有研究證明小檗堿能夠通過誘導自噬對非小細胞肺

3、癌起到放射增敏作用。另外,小檗堿也可通過抑制血管生成抑制腫瘤的生長。
　　 [研究目的]本課題主要研究小檗堿是否在食管鱗狀細胞癌放射治療中具有增敏作用,并對其放射增敏機制進行初步探討。
　　 [研究方法]為了完成上述研究目的,主要進行以下實驗:
　　 一、MTT方法檢測小檗堿對人食管癌細胞和人正常成纖維細胞的增殖抑制作用
　　 二、利用平板克隆實驗檢測小檗堿對人食管癌細胞和人正常成纖維細胞是否具有放射增敏

4、效果
　　 三、利用免疫熒光實驗檢測在小檗堿和／或X-ray處理細胞后γ-H2AX及RAD51焦點的形成與持續(xù)情況
　　 四、利用Western Blotting及Real—time PCR實驗檢測小檗堿和／或X—ray處理前后細胞內(nèi)RAD51、Ku70、Ku86的表達量有無差異
　　 五、利用流式細胞儀檢測小檗堿處理食管癌細胞后細胞周期的變化
　　 六、利用熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測小檗堿處理食管癌細胞后

5、對RAD51啟動子的調(diào)控作用
　　 七、RNA干擾實驗檢測RAD51缺失后對食管癌細胞是否起到放射增敏作用
　　 八、免疫組化實驗檢測在食管癌組織及癌旁正常組織中RAD51的表達情況
　　 [實驗結(jié)果]
　　 一、小檗堿對食管鱗癌細胞KYSE30、KYSE450及人正常成纖維細胞(HNF)具有明顯的抑制作用并呈劑量依賴性和時間依賴性。
　　 二、低濃度小檗堿對食管鱗癌細胞KYSE30和KYSE45

6、0具有明顯的放射增敏作用,而對人正常成纖維細胞無放射增敏作用。
　　 三、小檗堿預處理食管鱗癌細胞KYSE30和KYSE450,可以顯著抑制DNA雙鏈斷裂(DSBs)的修復,而不影響人類正常成纖維細胞對DSBs的修復。
　　 四、小檗堿對非同源末端連接(NHEJ)修復通路的關(guān)鍵蛋白Ku70、Ku86無下調(diào)作用,對同源重組(HR)修復通路的關(guān)鍵蛋白RAD51有明顯下調(diào)作用。
　　 五、小檗堿對RAD51的下調(diào)與細胞

7、周期的改變無關(guān)。
　　 六、小檗堿能夠下調(diào)電離輻射引起的RAD51的上調(diào)。
　　 七、小檗堿能夠作用于RAD51的啟動子,抑制RAD51的轉(zhuǎn)錄活性,從而對食管鱗癌細胞KYSE30和KYSE450起到放射增敏作用。
　　 八、RAD51缺失后可以對食管鱗癌細胞KYSE30和KYSE450起到放射增敏作用。
　　 九、RAD51在食管鱗癌組織中普遍高表達。
　　 [結(jié)論]低濃度小檗堿可以通過顯著下調(diào)D