鬼臼毒素衍生物ZM對骨肉瘤細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:探討由實(shí)驗(yàn)室合成的鬼臼毒素衍生物ZM對人源骨肉瘤細(xì)胞Hos在體外的作用效果及機(jī)制,為抗骨腫瘤藥物研制提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.MTT法和SRB法檢測ZM的體外抗腫瘤活性。
　　 MTT法和SRB法測定ZM在體外對各種腫瘤細(xì)胞(Hos、KB、KBv200、Hela、BGC-823、MCF-7、SMMC-7721、HepG)及正常細(xì)胞(VEC)的IC50或G150值。
　　 2.光學(xué)顯微鏡

2、、熒光顯微鏡觀察ZM作用后Hos細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。
　　 在對數(shù)生長期的Hos細(xì)胞中加入不同濃度ZM(1μM、2μM),作用于細(xì)胞24h,Giemsa染色后光學(xué)顯微鏡觀察照相并保留結(jié)果。同法進(jìn)行Hoechst33342熒光染色,以紫外光(340nm)激發(fā)Hoechst,熒光顯微鏡觀察照相并保留結(jié)果。
　　 3.瓊脂糖凝膠電泳分析ZM對Hos細(xì)胞染色體DNA斷裂的影響。
　　 在對數(shù)生長期Hos細(xì)胞,加入不同濃度Z

3、M(1μM、2μM)作用24h后抽提樣本DNA,于1.5％瓊脂糖膠電泳,電泳完成后用凝膠成像系統(tǒng)照相。VP-16(10μM)為陽性對照。
　　 4.RT-PCR法檢測不同濃度ZM(1μM、2μM)對Hos細(xì)胞bcl-2、bax、P53、P21、caspase-3、PCNA mRNA表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.ZM的體外抗腫瘤作用。
　　 本課題通過MTT和SRB法實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ZM對多種腫瘤細(xì)胞均有較

4、強(qiáng)的抑制作用,IC50范圍在0.43μmol/L～9.87μmol/L之間,且對耐藥細(xì)胞株KBv200也有抑制作用,IC50為6.67±0.22μmaol/L,具有抗多藥耐藥活性。但對正常細(xì)胞VEC IC50高于50μmol/L。同時(shí),ZM對人骨肉瘤細(xì)胞(Hos)有較強(qiáng)的抑制作用,其IC50為1.32±0.51μmol/L。
　　 通過繪制藥物作用Hos細(xì)胞6天的生長曲線,發(fā)現(xiàn)不同濃度ZM對Hos細(xì)胞的生長抑制作用顯著,且呈現(xiàn)較

5、好的量效關(guān)系。
　　 2.檢測鬼臼毒素衍生物ZM誘導(dǎo)Hos細(xì)胞的凋亡的效果
　　 把不同濃度ZM(1μM、2μM)作用于Hos細(xì)胞,24h后收集細(xì)胞。分別用Giemsa染料和Hoechst33342/PI熒光染料對細(xì)胞染色,前者能夠?qū)⒓?xì)胞核染為藍(lán)紫色,胞漿染為粉紅色。未加藥組細(xì)胞的細(xì)胞核染色均一,結(jié)構(gòu)完整且核漿比值較大;給藥組的細(xì)胞能夠看到細(xì)胞核的形態(tài)呈現(xiàn)出細(xì)胞凋亡典型特征:核膜皺縮,核固縮,核碎裂。用Hoechst33

6、342熒光染料對細(xì)胞染色,在紫外光的激發(fā)下可發(fā)出藍(lán)色熒光,在熒光顯微鏡下觀察能夠看到Hos細(xì)胞發(fā)生凋亡的細(xì)胞形態(tài)變化。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)出現(xiàn)集聚、碎裂,細(xì)胞膜也不斷地出芽并脫落,細(xì)胞亦碎裂為數(shù)個(gè)大小不同的凋亡體,伴隨著ZM濃度加大,鏡下這種具有特征性的形態(tài)學(xué)變化的細(xì)胞數(shù)目愈來愈多,凋亡的細(xì)胞比例亦逐漸增高,顯示出明顯的劑量依賴關(guān)系。
　　 在經(jīng)典的DNA降解斷裂檢測實(shí)驗(yàn)中,用不同濃度ZM分別作用于Hos細(xì)胞24h,提取DNA進(jìn)行瓊脂

7、糖凝膠電泳,可呈現(xiàn)典型的“DNA梯子樣”圖譜。
　　 因此,綜合以上可以認(rèn)為鬼臼毒素新衍生物作用于Hos細(xì)胞時(shí)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。
　　 3.ZM對Hos細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax、P53、P21、caspase-3、PCNA表達(dá)的影響
　　 本實(shí)驗(yàn)觀察了ZM對凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax、P53、P21、caspase-3和PCNA的mRNA表達(dá)的影響。經(jīng)不同濃度的ZM(1μM、2μM)作用于Hos細(xì)

8、胞24小時(shí),RT-PCR結(jié)果顯示ZM可上調(diào)bax、P53、P21、caspase3的mRNA表達(dá),同時(shí)下調(diào)bcl-2和PCNA mRNA的表達(dá),結(jié)果同對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05),且有一定的劑量依賴性。提示ZM誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用極可能依靠上調(diào)促凋亡基因bax、P53、P21、caspase-3表達(dá),同時(shí)下調(diào)凋亡抑制基因bcl-2、PCNA mRNA的表達(dá),從而誘骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　 結(jié)論:鬼臼毒素衍生物ZM的結(jié)