鬼臼毒素衍生物CWH-2誘導多耐藥細胞標K562-A02凋亡及其作用機制研究.pdf

1、目的:本文研究新型鬼臼類衍生物CWH-2對K562/A02細胞抗多藥耐藥作用，探究其作用機制，為鬼臼毒素衍生物結(jié)構(gòu)優(yōu)化奠定實驗基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、MTT法檢測CWH-2體外抗腫瘤活性。
　　MTT法檢測正常細胞(Hacat、FB)及多種腫瘤細胞(A549、Hela、SKOV3、SH-SY5Y、MCF-7、HepG-2、K562、K562/A02)的IC50值，分析CWH-2對K562/A02細胞的耐藥程度并繪制

2、K562及K562/A02細胞的生長曲線。
　　2、Giemsa染色法及Hoechst33342熒光染色法觀察細胞結(jié)構(gòu)的變化，初步探討CWH-2促凋亡作用及其機制。
　　3、瓊脂糖凝膠電泳法分析CWH-2誘導K562/A02細胞DNA斷裂的變化。
　　4、流式細胞術(shù)分析不同劑量CWH-2對K562及K562/A02細胞周期及凋亡率的影響。
　　5、RT-PCR檢測VP-16和不同濃度CWH-2對K562及K562

3、/A02細胞mdr-1、p53、Bax、caspase-3、PCNA、TopoⅡαmRNA表達的影響。
　　6、通過抑瘤率的計算研究不同劑量CWH-2治療動物移植腫瘤模型的效果。
　　結(jié)果:
　　1、WH-2體外抗腫瘤的活性
　　通過MTT法檢測發(fā)現(xiàn)CWH-2體外抗多種腫瘤細胞效果顯著，IC50值的范圍在0.39～8.63μmol/L之間，明顯高于已經(jīng)上市的臨床抗腫瘤藥物VP-16（3.74～67.44μmol/

4、L）的抗腫瘤活性。通過對親本白血病細胞株和其耐藥株的測定，CWH-2顯示出抗多藥耐藥的潛能。CWH-2對人源正常細胞Hacat和Fb的殺傷作用明顯減弱，其IC50分別為224.38±3.83μmol/L和60.93±1.05μmol/L，說明CWH-2對細胞的殺傷具有一定的特異甄別性。 MTT結(jié)果顯示:耐藥株K562/A02對ADM的耐藥倍數(shù)為41.14(親本K562細胞IC50=0.53±0.04μmol/L;其耐藥株K562/A02

5、細胞IC50=21.81±0.92μmol/L)，而通過對不同濃度CWH-2作用于K562和K562/A02后繪制生長曲線，結(jié)果顯示:相同藥物濃度的CWH-2和VP-16對同種細胞的抑制程度有明顯差異，CWH-2具有起效快，藥效持續(xù)，且具有劑量依賴性特點。
　　2、CWH-2體內(nèi)抗腫瘤作用
　　將CWH-2（20mg/kg/d、30mg/kg/d）連續(xù)腹腔注射6天，S180鼠肉瘤細胞的體內(nèi)生長抑制率（58.39％和64.48

6、％）與陰性對照組比較差異顯著(P＜0.01)，體重比陰性對照組比較沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。VP-16組抑瘤率為72.63％，死亡率明顯高于其它組，且體重比與陰性對照組比較有明顯差異(P＜0.01)。結(jié)果說明:CWH-2在體內(nèi)抑制腫瘤作用明顯，且毒性小于VP-16。
　　3、CWH-2誘導耐藥株細胞凋亡的研究
　　不同濃度CWH-2（3，8，12μmol/L）作用K562/A02細胞24h后，光學顯微鏡(10×)下顯示

7、:隨著藥物濃度的增加，細胞碎裂的程度增大，且藥效較VP-16明顯。進一步觀察發(fā)現(xiàn):未加藥組的腫瘤細胞染色均勻，形態(tài)飽滿，結(jié)構(gòu)完整;給藥組則出現(xiàn)明顯的細胞核皺縮現(xiàn)象，隨著濃度增加細胞膜破碎，并在高濃度組出現(xiàn)細胞核固縮成均一致密物，進而發(fā)生分裂，內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大改變，形成大小不一的凋亡小體排出膜外。在熒光顯微鏡下觀察凋亡的特征更加突出，發(fā)生裂變的細胞呈亮藍色，高濃度組的凋亡小體數(shù)量最多。通過瓊脂糖凝膠電泳試驗，試驗結(jié)果顯示:經(jīng)過藥物作用后的

8、細胞，其核小體已斷裂形成DNA片斷，經(jīng)過提取和純化后在凝膠電泳上產(chǎn)生n條帶，形成了典型的“DNA iadder”圖譜。分析流式細胞術(shù)檢測藥物作用后的細胞凋亡率的結(jié)果，從整體來看，無論是24h，還是時間達至48h，細胞的凋亡率隨藥物劑量的增大而增大，且濃度越高增漲幅度越大。并且，從凋亡率來看，在48h時三種劑量的CWH-2均高于VP-16。K562/A02細胞在藥物CWH-2作用下的凋亡率具有時間及劑量依賴性的特點。
　　以上從形態(tài)

9、學、瓊脂糖凝膠電泳試驗、流式細胞術(shù)三個實驗的結(jié)果證實CWH-2對白血病耐藥株K562/A02具有促使其凋亡的作用。
　　4、CWH-2對白血病耐藥株K562/A02生長周期的影響
　　不同濃度CWH-2（3，8，12μmol/L）作用于K562/A02細胞24h、48h，結(jié)果顯示:24h和48h細胞周期被阻斷于S期。
　　5、CWH-2對K562/A02和（或）K562多種基因mdr-1、TopoⅡα，p53、Bax、

10、caspase-3、PCNA的mRNA表達影響。
　　不同濃度CWH-2(K562:2，4，8μmol/L; K562/A02:3，8，12μmol/L)作用于K562和（或）K562/A02細胞24小時后，RT-PCR結(jié)果顯示:CWH-2可下調(diào)K562細胞PCNA mRNA的表達，上調(diào)p53、Bax、caspase-3、TopoⅡαmRNA的表達;CWH-2可下調(diào)K562/A02細胞mdr-1、PCNA mRNA的表達，上調(diào)p5

11、3、Bax、caspase-3、TopoⅡαmRNA的表達。
　　結(jié)論:CWH-2對多種人源腫瘤細胞具有抑制生長及殺傷作用，尤其是對具有多藥耐藥性的腫瘤細胞具有抗耐藥性的特點。體外細胞實驗顯示:CWH-2較陽性對照藥VP-16的抗腫瘤活性更強，并且影響K562/A02細胞的生長周期，增加其凋亡率;體內(nèi)S180動物瘤體實驗顯示:雖然CWH-2與VP-16的抑瘤效果相當，但毒性明顯降低。探索其分子機制，可能與多種基因相關(guān):1.參與p5