DATS逆轉(zhuǎn)K562-A02細胞耐藥的機制研究.pdf

1、研究目的：
　　 急性白血病是一種嚴重危害人類健康的血液腫瘤。惡性腫瘤表現(xiàn)出來的耐藥性一直是治療失敗的主要原因。其中P-gp介導(dǎo)的MDR是腫瘤耐藥性的主要機制。逆轉(zhuǎn)MDR可以使化療失敗的機率下降，具有很高的臨床價值，已成為目前國內(nèi)外化療藥物研究的重要方向之一。已發(fā)現(xiàn)的多種逆轉(zhuǎn)劑缺乏腫瘤細胞識別特異性，會導(dǎo)致化療藥物藥動學(xué)發(fā)生改變，增加毒性，如藥物清除率下降、半衰期延長、血液濃度增高、分配體積增加等，這些都會增加對正常組織的毒性。

2、植物來源的藥物資源豐富，作用靶點多，具有高效低毒的優(yōu)點，顯示其在逆轉(zhuǎn)MDR方面有較好的應(yīng)用前景。本研究應(yīng)用大蒜素提取物DATS處理K562/A02細胞，觀察其對阿霉素的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，評價DATS與小劑量維拉帕米合用逆轉(zhuǎn)耐藥的效果極其毒性作用，并就其逆轉(zhuǎn)作用的分子機制進行深入探討。
　　 研究內(nèi)容和方法：
　　 1.甲基四唑藍(MTT)法增殖抑制實驗1.1測定DATS和VRP對細胞的毒性作用，藥物對細胞生長抑制率(％)=(

3、1-實驗孔A值/對照孔A值)×100％，根據(jù)線性回歸方程求得10％的細胞生長受到抑制所需藥物濃度(IC10)。選取DATS和VRP分別低于各自IC10的一個濃度，作為下述實驗所需安全濃度，并測定二者以此濃度聯(lián)合應(yīng)用對K562/A02細胞生長的抑制率。
　　 1.2測定不同劑量的DATS聯(lián)合阿霉素(ADM)對K562/A02細胞抑制率的量效和時效關(guān)系對照組加入終濃度為5ug/ml的ADM，實驗組加入終濃度為5ug/ml的ADM和不

4、同濃度的DATS，培養(yǎng)24、48、72小時后，上酶標儀測定A值。計算不同作用時間不同劑量的DATS和ADM聯(lián)合作用對細胞的生長抑制率。
　　 1.3測定逆轉(zhuǎn)劑對細胞藥物敏感性的影響：
　　 加入不同濃度ADM培養(yǎng)48小時后，計算阿霉素對對照組和各加藥組細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。耐藥倍數(shù)=耐藥株IC50/敏感株IC50：逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=耐藥株IC50/加逆轉(zhuǎn)劑后IC50。
　　 2.光鏡下細胞形態(tài)的改變?nèi)?shù)生長期

5、的K562/A02細胞制成濃度為1×105/mL的細胞懸液，接種于預(yù)先鋪置無菌蓋玻片的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，分組為：
　　 ①K562/A02，②K562/A02+ADM③ K562/A02+DATS+ADM②、③組內(nèi)均加入終濃度ADM1μg/mL，③組加入IC10濃度的DATS。在37℃，5％CO2，及飽和濕度下培養(yǎng)24、48、72小時后，用HE法染色，光鏡下觀察，拍照。
　　 3.流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)ADM濃度取對數(shù)生長期

6、的K562和K562/A02細胞，實驗分組：
　　 ①K562
　　 ②K562/A02③K562+ADM④K562/A02+ADM⑤K562/A02+DATS+ADM⑥K562/A02+VRP+ADM⑦K562/A02+DATS+VRP+ADM以⑥組作為陽性對照，以④組作為陰性對照。DATS和VRP終濃度為IC10所需濃度。調(diào)整各組細胞濃度為1×105/mL，分別加入DATS或VRP培養(yǎng)48h后，③-⑦加入終濃度為5μ

7、g/mL的ADM，再共同培養(yǎng)2小時利用ADM自身熒光的特性，經(jīng)FCM檢測對照組和各加藥組細胞內(nèi)ADM熒光強度。
　　 4.流式細胞術(shù)檢測細胞膜P-gp取對數(shù)生長期的K562和K562/A02細胞，使其濃度為1×105/mL，分為①K562組②K562/A02組⑧K562/A02+DATS組④K562/A02+VRP組⑤K562/A02+DATS+VRP組每組平行3瓶。DATS和VRP終濃度為IC10所需濃度。對照組和各加藥組細胞

8、在37℃，5％CO2，及飽和濕度下培養(yǎng)48小時。加入藻紅蛋白(PE)標記的鼠抗人P-gp單抗P-gp-PE和同型對照IgG2a-PE6μl，用流式細胞術(shù)檢測細胞膜P-gp。
　　 5.流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡取對數(shù)生長期的K562/A02細胞，使其濃度為1×105/mL，接種于50ml培養(yǎng)瓶中。分組：
　　 ①K562/A02組②K562/A02+DATS組③K562/A02+VRP組④K562/A02+DATS+VRP組

9、每組平行3瓶。DATS和VRP終濃度為IC10所需濃度。對照組和各加藥組細胞在37℃、5％CO2、飽和濕度下培養(yǎng)48小時。加5μl Annexin V/FITC和10μl(20μg/ml)的PI溶液，用流式細胞儀檢測細胞凋亡，F(xiàn)ACS軟件分析數(shù)據(jù)。右下象限是Annexin V+PI-細胞為早期凋亡細胞。
　　 6.RT-PCR檢測基因的改變?nèi)?shù)生長期K562/A02細胞，分別用含10％滅活新生牛血清的RPMI-1640稀釋成1

10、×105/mL，接種于50ml培養(yǎng)瓶中，實驗分為①K562組②K562/A02組③K562/A02+DATS組④K562/A02+VRP組⑤K562/A02+DATS+小劑量VRP組⑥K562/A02+DATS+VRP組，每組平行3瓶。DATS和VRP終濃度為IC10所需濃度。小劑量VRP終濃度為1/2 IC10所需濃度。在37℃，5％CO2，及飽和濕度下培養(yǎng)48小時。采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，檢測各組細胞多藥耐藥基因mdrl及凋亡

11、相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Caspase-3，和NF-κB/p65、IκBα的mRNA表達7.Western blot檢測蛋白在細胞膜上的表達取對數(shù)生長期K562/A02細胞，分別用含10％滅活新生牛血清的RPMI-1640稀釋成1×105/mL，接種于50ml培養(yǎng)瓶中，實驗分為：
　　 ①K562組
　　 ②K562/A02組③K562/A02+DATS組④K562/A02+VRP組⑤K562/A02+DATS+小劑

12、量VRP組⑥K562/A02+DATS+VRP組每組平行3瓶。DATS和VRP終濃度為IC10所需濃度。小劑量VRP終濃度為1/2 IC10所需濃度。在37℃，5％CO2，及飽和濕度下培養(yǎng)48小時。各組細胞提取細胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，以鼠抗人Mdr-1抗體、兔抗人NF-κB/p65抗體、鼠抗人IκBα抗體、兔抗人Caspase-3蛋白單克隆抗體作為一抗，二抗為HRP(辣根過氧化物酶)標記的羊抗兔Ig

13、G，DAB顯色，掃描結(jié)果，以密度值反應(yīng)蛋白表達量。
　　 9.統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析處理。實驗組與對照組之間采用t檢驗，多組間的比較采用單向方差分析的方法。析因設(shè)計資料采用雙因素分析方法，并繪制交互作用圖，若兩條線是平行的，則說明沒有交互作用。P<0.05則認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.MTT檢測結(jié)果DATS和VRP對K562/A02細胞的I

14、C10分別為2.31±0.22μmol/L和4.03±0.13μg/ml。選擇DATS2μmol/L、VRP4μg/ml作為安全范圍藥物劑量用于下面的實驗。以此濃度的DATS和VRP聯(lián)合作用于K562/A02細胞，培養(yǎng)48小時后，細胞的生存率為：92.72±3.26％。兩藥合用毒性并無相加。
　　 不同劑量的DATS聯(lián)合阿霉素(ADM)對K562/A02細胞抑制率的具有量效和時效關(guān)系。
　　 DATS單藥時對K562/A

15、02細胞耐藥逆倍數(shù)為3.789，VRP單藥時對K562/A02細胞耐藥逆倍數(shù)為12.31，聯(lián)合應(yīng)用(2μg/ml)VRP和DATS的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為12.21，聯(lián)合應(yīng)用(4μg/ml)VRP和DATS的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為34.38，證明DATS和VRP聯(lián)合應(yīng)用可以增加逆轉(zhuǎn)作用，且小劑量VRP和DATS聯(lián)合應(yīng)用可以達到大劑量VRP單藥的逆轉(zhuǎn)效果。
　　 2.光鏡下細胞形態(tài)的改變未加入逆轉(zhuǎn)劑時，K562/A02細胞增殖旺盛，核分裂像多見。單獨應(yīng)用

16、ADM(1μg/mL)作用48小時，K562/A02細胞增殖率抑制不明顯。K562/A02+ADM+DATS組培養(yǎng)24小時，細胞數(shù)目明顯減少，核分裂像少見。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，部分細胞被裂解成數(shù)個大小不等的小體，細胞體積縮小，染色質(zhì)凝聚附在核膜周邊，嗜堿性增強，細胞核固縮呈均一的致密物，可見凋亡小體，部分核碎裂。72小時后，細胞數(shù)目更少，凋亡細胞比例增加。
　　 3.流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)ADM濃度：K562細胞和K562/A02

17、細胞內(nèi)自身熒光強度很弱，分別為0.36±0.13和0.59±0.04。K562細胞經(jīng)ADM處理后，細胞內(nèi)ADM熒光強度為4.24±0.15，K562/A02細胞經(jīng)ADM處理后，細胞內(nèi)ADM熒光強度為2.49±0.27，與K562細胞比較有顯著性差異(P<0.01)。加入DATS或VRP后，K562/A02細胞中的ADM熒光強度比加藥前明顯增強(P<0.01)。各加藥組間相比無顯著性差異。
　　 4.流式細胞術(shù)檢測細胞膜P-gp：

18、K562細胞P-gp表達率極低(0.53±0.07)，K562/A02細胞P-gp表達率高(9.16±1.27)，與K562細胞有顯著性差異(P<0.01)。加入逆轉(zhuǎn)劑DATS或VRP后，K562/A02細胞的P-gp表達率明顯降低(P<0.01)。各加藥組間無顯著性差異。
　　 5.流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡K562/A02細胞的自然凋亡率是0.90±0.17％，加入DATS后凋亡率為12.15±0.78％，加入VRP后凋亡率為1

19、1.55±1.91％，兩藥合用時凋亡率為12.55±0.64K562/A02組和各加藥組間均有顯著性差異(P=0.000)。各加藥組間無顯著性差異。
　　 6.RT-PCR檢測基因的改變K562/A02組的NF-κB/p65表達明顯強于K562組(P<0.05)。各加藥組均可以明顯減弱K562/A02細胞的NF-κB/p65表達。(P<0.01)。K562組細胞的IκBα表達明顯高于K562/A02組細胞。DATS、VRP單獨使

20、用對提高K562/A02組細胞IκBα的表達作用不明顯(P=0.4，0.133)。兩藥合用效果優(yōu)于單藥(P<0.05)。DATS對Bcl-2(P=0.166)、Bax(P=0.062)的表達作用不明顯。K562/A02細胞mdr-1表達明顯高于K562細胞(P=0.000)。各加藥組均可明顯減弱K562/A02細胞的mdr-1表達(P<0.05)。K562細胞Caspase_3表達明顯高于K562/A02細胞(P=0.000)，各加藥組

21、均可以明顯增加K562/A02細胞的Caspase_3表達(P<0.01)。
　　 7.Western blot檢測K562/A02細胞膜上蛋白表達的變化：
　　 K562細胞NF-κB/p65表達率明顯弱于K562/A02細胞(P<0.01)，各加藥組均可以明顯減弱K562/A02細胞的NF-κB/p65表達(P<0.01)。K562細胞IκBα表達明顯強于K562/A02細胞(P<0.05)。DATS、VRP單用對I

22、κBα增強作用不明顯(P=0.445，0.117)，兩藥合用效果優(yōu)于單藥(P<0.05)。K562細胞mdr-1表達明顯弱于K562/A02細胞(P=0.000)。各加藥組均可明顯減弱K562/A02細胞的mdr-1表達(P<0.05)。K562細胞的Caspase-3表達明顯高于K562/A02細胞(P<0.05)，各加藥組均可以明顯增加K562/A02細胞的Caspase_3表達(P<0.05)。
　　 結(jié)論：