環(huán)孢菌素A聯(lián)合雌激素受體抑制劑逆轉(zhuǎn)K562-A02細(xì)胞多藥耐藥的研究.pdf

1、目的：本課題旨在研究環(huán)孢菌素A(CsA)聯(lián)合雌激素受體抑制劑雷洛昔芬(raloxifene)單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病急性紅白血病變細(xì)胞株K562及其耐藥細(xì)胞株K562/A02 P糖蛋白(P.glycoprotein，P-gP)表達(dá)的影響，以探討它們逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用機(jī)理，為環(huán)孢菌素A和雌激素受體抑制劑雷洛昔芬作為耐藥逆轉(zhuǎn)劑的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法：(1)采用甲基四唑藍(lán)法(MTT)法檢測(cè)雷洛昔芬(2.5mg/L)及

2、CsA(1ing/L)單獨(dú)及聯(lián)合作用于K562細(xì)胞和K562/A02細(xì)胞一定時(shí)間柔紅霉素fDNR)對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制量：(2)采用半定量PCR(RT-PCR)法檢測(cè)K562細(xì)胞、雷洛昔芬(2.5mgm)及CsA(1mg/L)單獨(dú)及聯(lián)合作用于K562/A02細(xì)胞一定時(shí)間細(xì)胞多藥耐藥基因(mdrl基因)mRNA表達(dá)水平：(3)采用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)K562細(xì)胞、雷洛昔芬(2.5mg/L)及CsA(1mg/L)單獨(dú)及聯(lián)合作用于K562/A

3、02細(xì)胞一定時(shí)間細(xì)胞膜上P-gP的表達(dá)。(4)FCM檢測(cè)K562細(xì)胞、雷洛昔芬(2.5mg/L)及CsA(1 mg/L)單獨(dú)及聯(lián)合作用于K562/A02細(xì)胞一定時(shí)間細(xì)胞內(nèi)DNR濃度。(5)FCM檢測(cè)雷洛昔芬(2.5mg/L)及CsA(1mg/L)單獨(dú)及聯(lián)合作用于K562/A02細(xì)胞一定時(shí)間細(xì)胞的凋亡。 結(jié)果：(1)逆轉(zhuǎn)劑處理前后DNR對(duì)K562細(xì)胞和K562/A02細(xì)胞的毒性作用：OK562/A02、K562細(xì)胞IC50值分別為

4、23.51和0.29mg/L<,1>②雷洛昔芬及CsA單獨(dú)聯(lián)合處理K562細(xì)胞IC50值無(wú)明顯影響：③雷洛昔芬及CsA單獨(dú)處理K562/A02細(xì)胞的IC50值分別為5.98、8.15 mg/L，兩藥聯(lián)合作用增強(qiáng)IC50值為3.68mg/L：(2)未加逆轉(zhuǎn)劑K562/A02耐藥株細(xì)胞48h凋亡率為9.73﹪；K562/A02經(jīng)CsA(1mg/L)，雷洛昔芬(2.5mg/L)及CsA(1mg/L)+雷洛昔芬(2.5mg/L)聯(lián)合作用48h，

5、凋亡率分別為30.34﹪，10.10﹪，30.53﹪。本組實(shí)驗(yàn)顯示小劑量的CsA可以誘導(dǎo)部分細(xì)胞凋亡，小劑量的雷洛昔芬無(wú)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。(3)RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞mdrl mRNA的表達(dá)：①K562細(xì)胞mdrlmRNA表達(dá)為陰性,K562/A02細(xì)胞mdrl mRNA表達(dá)為陽(yáng)性：②K562/A02細(xì)胞的空白對(duì)照組mdrl/β-action為1.313，CsA組為1.232，雷洛昔芬組為1.052，兩藥聯(lián)合組為0.449，我們對(duì)下調(diào)率

6、進(jìn)行了分析，CsA及雷洛昔芬單獨(dú)作用后耐藥株mdrlmRNA下調(diào)微弱，聯(lián)合用藥下調(diào)效果明顯；(4)FCM檢測(cè)細(xì)胞膜P-gp的表達(dá)水平的變化：K562敏感株、K562/A02耐藥株P(guān)-gp熒光強(qiáng)度分別為3.58及104.96。后者經(jīng)CsA、雷洛昔芬及CsA和雷洛昔芬聯(lián)合作用48h,P-gp熒光強(qiáng)度分別為78.29，85.02和57.89。CsA及雷洛昔芬處理過(guò)的耐藥株P(guān)-gp蛋白的熒光強(qiáng)度下調(diào)，兩藥聯(lián)合下調(diào)更明顯，具有協(xié)同作用。(5)FC

7、M檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNR濃度：①K562/A02耐藥株細(xì)胞內(nèi)DNR濃度為K562敏感株的12﹪；②K562/A02經(jīng)CsA雷洛昔芬及兩藥聯(lián)合作用48h，細(xì)胞內(nèi)DNR濃度分別為K562敏感株的33﹪，12.78﹪和45.29﹪。CsA處理組及CsA聯(lián)合雷洛昔芬處理組，細(xì)胞內(nèi)DNR濃度明顯增加，與K562/A02對(duì)照組間有顯著性差異。細(xì)胞內(nèi)部的DNR濃度上升，與MTT法所反映的細(xì)胞存活率下降是一致的。數(shù)據(jù)資料以x±sD表示，用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)