異硫氰酸苯乙酯對K562-A02細胞耐藥逆轉的研究.pdf

1、目的:本課題旨在研究異硫氰酸苯乙酯（phenylhexyl isothiocyanate，PHI）單獨及聯(lián)合阿霉素（Adriamycin，ADM）對人慢性粒細胞白血病急性紅白血病變細胞株K562及其耐藥細胞株K562/A02作用及其機制，同時研究PHI對K562/A02細胞ADM耐藥性與敏感性的影響，為PHI的進一步研究及臨床應用提供理論依據(jù)。 方法:（1）采用甲基四唑藍法（MTT）法檢測PHI、PHI+ADM和ADM分別作用于

2、K562/A02細胞和K562細胞24、48和72h對細胞的增殖影響，計算出其半數(shù)抑制量（50％Inhibiting Concentration， IC50）、逆轉倍數(shù)（Fold Reversal，F(xiàn)R）；（2）采用流式細胞儀（Flow Cytometry， FCM）檢測不同濃度PHI對K562細胞和K562/A02細胞的周期和凋亡，以及PHI與1μg/ml ADM聯(lián)合運用時細胞內ADM濃度的變化；（3）分光光度儀（Spectromet

3、ric enzyme assay）測定PHI作用前后細胞內還原性谷胱甘肽（GSH）含量的變化；（4）采用FCM檢測PHI單藥作用前后P糖蛋白1（P-gp1）和多藥耐藥性相關蛋白1（MRP1）的變化；（5）采用半定量PCR（RT-PCR）測定細胞P-gp1、MRP1 mRNA表達變化。 結果:（1）PHI對K562、K562/A02細胞的作用有濃度和時間依賴性。其中，PHI48h作用K562/A02、K562的IC50分別為（64

4、.3±3.83）μmol/l和（63.5±3.93）μmol/l，兩者間無顯著差異（p>0.05）； ADM作用48h對K562/A02、K562細胞的IC50值分別為（57.43±4.55）μg/ml和（1.16±0.05）μg/ml，K562/A02對ADM的耐藥倍數(shù)為49.51倍；PHI+ADM合用組，PHI≥10μmol/l時，ADM對兩組細胞的IC50均下降（p<0.05），當PHI≥20μmol/l其耐藥FR變化差異顯著（p

5、<0.05）。（2）FCM檢測顯示①當0μmol/l PH1作用于K562/A02細胞G1期占（30.65±0.92）％，40μmol/l時G1期占（47.49±0.93）％，隨著PHI的濃度增加K562/A02細胞周期G1期比例增加。②對照組K562/A02細胞48h凋亡率為（1.83±0.35）％；1μg/ml的ADM單獨作用于K562/A02細胞凋亡率為（1.87±0.39）％，ADM與PHI聯(lián)合使用后K562/A02細胞的凋亡隨

6、著PHI濃度的增加而增加。③1μg/ml ADM作用K562/A02細胞48h，細胞內ADM平均熒光強度為（87.00±4.64），當加入≥20μmol/lPHI的濃度時，K562/A02細胞內ADM藥物濃度增加有顯著差異（P<0.05）。（3）分光光度儀檢測發(fā)現(xiàn)：K562/A02細胞與K562細胞中GSH的濃度之比為1.8，顯示耐藥株腫瘤細胞內較高的GSH濃度。單獨運用1μg/ml ADM作用48h K562/A02細胞內的GSH含量

7、下降5％；單獨PHI作用48h K562/A02細胞內的GSH含量隨著PHI濃度的增加先是輕度升高后下降，GSH含量下降點在PHI為10μmol/l時；當PHI≥20μmol/l與1μg/mlADM聯(lián)合運用48h時，K562/A02細胞內的GSH含量隨著PHI濃度的升高進行性下降。（4）FCM測定K562/A02細胞膜P-gp1的值為（98.28±1.71）％，K562細胞P-gp1為（0.60±0.21）％，兩者有明顯差異（P<0.0

8、5）。加入不同濃度的PHI作用48h，當PHI≥40μmol/l時，K562/A02細胞膜P-gp1表達下降出現(xiàn)差異（P<0.05）。K562/A02細胞、K562細胞MRP1分別為（98.81±1.72）％和（98.43±1.71）％，兩者無明顯差異（P>0.05）。（5）RT-PCR檢測顯示K562細胞MDR1 mRNA表達為陰性，K562/A02細胞MDR1 mRNA表達為陽性；相應的MDR1/β-action灰度值下降亦在PHI

9、≥40μmol/l時出現(xiàn)差異（P<0.05）；兩細胞株之間的MRP1 mRNA無差異（p>0.05），而不同濃度PHI作用于K562/A02細胞MRP1 mRNA變化亦無差異（p>0.05）。 結論:（1）PHI對K562/A02細胞有時間、劑量依賴性的細胞毒作用，其作用與細胞內GSH耗竭無線性關系。（2）聯(lián)合使用PHI可減少ADM的用量，而降低其毒副作用。（3）PHI不但可以增強K562/A02細胞對ADM的敏感性，而且具有一