應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制MDR1或-和MCL1基因?qū)Χ嗨幠退幇籽?xì)胞K562-A02耐藥影響的研究.pdf

1、目的構(gòu)建多藥耐藥-1基因(MDR1)和髓細(xì)胞白血病-1基因(MCLI)的RNA干擾表達(dá)質(zhì)粒載體，觀察單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)耐藥白血病K562-A02細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，探討兩個(gè)基因聯(lián)合治療對(duì)逆轉(zhuǎn)耐藥的協(xié)同作用。 @2 方法根據(jù)MDRl和MCL1基因表達(dá)序列選取有效的RNA干擾靶序列，分別使用siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體，構(gòu)建兩種基因特異性siRNA表達(dá)質(zhì)粒，重組質(zhì)粒酶切及DNA測(cè)序鑒定；然后在脂質(zhì)體介導(dǎo)下分別和聯(lián)合轉(zhuǎn)染K562/A02細(xì)胞，用G41

2、8和/或Hygro B篩選出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆。RT-PCR分析MDRl和MCLl基因mRNA的表達(dá)；流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞膜P-gp相對(duì)表達(dá)量；MTT法檢測(cè)細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞的阿霉素的相對(duì)濃度；MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后K562/A02細(xì)胞的阿霉素半數(shù)抑制濃度(IC<,50>)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果： 1．成功構(gòu)建兩個(gè)基因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，測(cè)序和酶切結(jié)果證實(shí)插入序列正確。 2

3、．MDRl基因的siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K562/A02細(xì)胞可有效封閉相應(yīng)基因表達(dá)，其MDRl基因的mRNA表達(dá)相對(duì)水平是未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的56％。細(xì)胞P-gp相對(duì)表達(dá)量明顯下降(P<0.01)。激光共聚焦檢測(cè)在相同阿霉素濃度孵育下細(xì)胞內(nèi)藥物濃度較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)。細(xì)胞對(duì)阿霉素的藥物IC<'50>是1.70±0.30mg/L，耐藥逆轉(zhuǎn)率是63.8％(P<0.01)。阿霉素孵育72小時(shí)后細(xì)胞凋亡率5.33±0.40％(P<0.01)。

4、3．MCLl基因的siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K562/A02細(xì)胞可有效封閉相應(yīng)基因表達(dá)，其MCLl基因的mRNA表達(dá)相對(duì)水平是未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的42％。細(xì)胞P-gp相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯變化。激光共聚焦測(cè)在相同阿霉素濃度孵育下細(xì)胞內(nèi)藥物濃度較對(duì)照組無(wú)顯著差異。細(xì)胞對(duì)阿霉素的藥物IC<,50>是1.37±0.25 mg/L，耐藥逆轉(zhuǎn)率是71.1％(P<0.01)。阿霉素孵育72小時(shí)后細(xì)胞凋亡率5.874±0.25％(P<0.01)。 4．共轉(zhuǎn)染兩種

5、質(zhì)粒組細(xì)胞MDRl基因和MCLl基因表達(dá)相對(duì)水平分別是對(duì)照的52％、44％。細(xì)胞P-gp相對(duì)表達(dá)量明顯下降(P<0.01)。激光共聚焦測(cè)在相同阿霉素濃度孵育下細(xì)胞內(nèi)藥物濃度較對(duì)照明顯升高(P<0.01)。細(xì)胞對(duì)阿霉素的藥物IC<,50>是0.83±0.15 mg/L，耐藥逆轉(zhuǎn)率是83.1％(p<0.01)。阿霉素孵育72小時(shí)后細(xì)胞凋亡率7.77±0.42％(P<0.01)。聯(lián)合轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒和單獨(dú)轉(zhuǎn)染比較，細(xì)胞對(duì)阿霉素敏感性和凋亡率皆有顯