應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制MDR1或-和MCL1基因?qū)Χ嗨幠退幇籽毎鸎562-A02耐藥影響的研究.pdf

1、目的構(gòu)建多藥耐藥-1基因(MDR1)和髓細胞白血病-1基因(MCLI)的RNA干擾表達質(zhì)粒載體，觀察單獨和聯(lián)合應(yīng)用對耐藥白血病K562-A02細胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，探討兩個基因聯(lián)合治療對逆轉(zhuǎn)耐藥的協(xié)同作用。 @2 方法根據(jù)MDRl和MCL1基因表達序列選取有效的RNA干擾靶序列，分別使用siRNA質(zhì)粒表達載體，構(gòu)建兩種基因特異性siRNA表達質(zhì)粒，重組質(zhì)粒酶切及DNA測序鑒定；然后在脂質(zhì)體介導(dǎo)下分別和聯(lián)合轉(zhuǎn)染K562/A02細胞，用G41

2、8和/或Hygro B篩選出穩(wěn)定表達的細胞克隆。RT-PCR分析MDRl和MCLl基因mRNA的表達；流式細胞儀測定細胞膜P-gp相對表達量；MTT法檢測細胞的細胞生長曲線；激光共聚焦檢測細胞的阿霉素的相對濃度；MTT法檢測轉(zhuǎn)染前后K562/A02細胞的阿霉素半數(shù)抑制濃度(IC<,50>)；流式細胞儀檢測細胞凋亡率。 結(jié)果： 1．成功構(gòu)建兩個基因的siRNA表達質(zhì)粒，測序和酶切結(jié)果證實插入序列正確。 2

3、．MDRl基因的siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K562/A02細胞可有效封閉相應(yīng)基因表達，其MDRl基因的mRNA表達相對水平是未轉(zhuǎn)染細胞的56％。細胞P-gp相對表達量明顯下降(P<0.01)。激光共聚焦檢測在相同阿霉素濃度孵育下細胞內(nèi)藥物濃度較對照組明顯升高(P<0.01)。細胞對阿霉素的藥物IC<'50>是1.70±0.30mg/L，耐藥逆轉(zhuǎn)率是63.8％(P<0.01)。阿霉素孵育72小時后細胞凋亡率5.33±0.40％(P<0.01)。

4、3．MCLl基因的siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K562/A02細胞可有效封閉相應(yīng)基因表達，其MCLl基因的mRNA表達相對水平是未轉(zhuǎn)染細胞的42％。細胞P-gp相對表達量無明顯變化。激光共聚焦測在相同阿霉素濃度孵育下細胞內(nèi)藥物濃度較對照組無顯著差異。細胞對阿霉素的藥物IC<,50>是1.37±0.25 mg/L，耐藥逆轉(zhuǎn)率是71.1％(P<0.01)。阿霉素孵育72小時后細胞凋亡率5.874±0.25％(P<0.01)。 4．共轉(zhuǎn)染兩種

5、質(zhì)粒組細胞MDRl基因和MCLl基因表達相對水平分別是對照的52％、44％。細胞P-gp相對表達量明顯下降(P<0.01)。激光共聚焦測在相同阿霉素濃度孵育下細胞內(nèi)藥物濃度較對照明顯升高(P<0.01)。細胞對阿霉素的藥物IC<,50>是0.83±0.15 mg/L，耐藥逆轉(zhuǎn)率是83.1％(p<0.01)。阿霉素孵育72小時后細胞凋亡率7.77±0.42％(P<0.01)。聯(lián)合轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒和單獨轉(zhuǎn)染比較，細胞對阿霉素敏感性和凋亡率皆有顯