三氧化二砷逆轉(zhuǎn)白血病耐藥細胞凋亡抑制中耐藥基因mdr1和凋亡抑制基因的表達.pdf

1、目的：研究As2O3誘導(dǎo)白血病K562/ADM耐藥細胞凋亡過程中多藥耐藥基因(mdr1)和凋亡調(diào)控基因的表達，探討As2O3逆轉(zhuǎn)耐藥白血病細胞凋亡抑制的分子機制。 方法： 以高表達mdr1的白血病多藥耐藥細胞K562/ADM為靶細胞，應(yīng)用噻唑藍(MTT)比色法檢測細胞增殖活性，細胞形態(tài)學(xué)、DNA片段化、細胞周期改變和AnnexinV/PI雙標記檢測K562/ADM細胞凋亡；流式細胞術(shù)(FCM)測定K562/ADM細胞Bc

2、l-2蛋白和P-gp表達水平、Caspase-3活性和細胞內(nèi)阿霉素(ADM)含量；ROS水平分別采用激光共聚焦顯微鏡和FCM檢測；RT-PCR檢測Bcl-2、Survivin、Caspase-3和mdr1mRNA的表達。 結(jié)果：As2O3可抑制K562/ADM細胞增殖，呈濃度依賴性和時間依賴性(γ24h=0.921，γ48h=0.939，γ72h=0.865，P＜0.01)；As2O3誘導(dǎo)K562/ADM細胞出現(xiàn)典型凋亡形態(tài)改變

3、，包括膜起泡，染色體凝集，及凋亡小體的形成；DNA電泳出現(xiàn)梯狀條帶(DNAladder)；AnnexinV/PI雙染顯示凋亡細胞明顯增高，5μmol/LAs2O3處理24h和48h細胞凋亡率分別為31.6％和55.8％；2-5μmol/LAs2O3作用24h，細胞被阻滯在G2/M期，G1期細胞減少，72h時Sub-G1期細胞分別為25.6％和52.9％。K562/ADM細胞mdr1/P-gp高表達，As2O3作用24-48h后，K562

4、/ADM細胞mdr1基因mRNA的表達明顯下調(diào)，72h時P-gp陽性率變化不明顯，96h時P-gp合成量降低，表達陽性率由97.2％降低至96.0％-91.2％，平均熒光強度由19.0降低至9.24-7.43，同時發(fā)現(xiàn)P-gp功能受抑，細胞內(nèi)ADM含量顯著增高。RT-PCR證實2-5μmol/LAs2O3作用24h-48h，survivinmRNA表達顯著下降，48h的抑制率21.5％和68.8％。K562/ADM細胞bcl-2mRNA

5、和bcl-2蛋白高表達。2-5μmol/LAs2O3作用24h，bcl-2mRNA表達降低，24-96h時bcl-2蛋白表達陽性率和平均熒光強度下降，并呈時間濃度依賴性。Caspase-3mRNA檢測顯示2-5μmol/LAs2O3作用24h后，Caspase-3mRNA的表達上調(diào)，作用24-48h后Caspase-3活性逐漸增強，48h時Caspase-3陽性率由17.9％增加到30.0-47.4％。K562/ADM細胞內(nèi)固有活性氧水

6、平高，經(jīng)2μmol/LAs2O3作用12-72h發(fā)現(xiàn)ROS水平變化不明顯，5μmol/LAs2O3作用24-72h，ROS表達陽性率均下降，尤以5μmol/LAs2O3處理72h時，下降明顯，由94.4％下降至40.5％。激光共聚焦檢測顯示，2-5μmol/LAs2O3作用24-48h后，細胞表現(xiàn)出凋亡形態(tài)變化，凋亡細胞內(nèi)DCF熒光減弱，表明ROS降解、水平下降。 結(jié)論：As2O3誘導(dǎo)白血病多藥耐藥K562/ADM細胞凋亡，逆轉(zhuǎn)