MDR1基因siRNA的篩選及其逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥的研究.pdf

1、目的:腫瘤的多藥耐藥是癌癥化療失敗的主要原因之一，多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是指腫瘤對(duì)一種化療藥物出現(xiàn)耐藥的同時(shí)，對(duì)其他結(jié)構(gòu)和功能各異的藥物亦產(chǎn)生交叉耐藥現(xiàn)象。P-糖蛋白(P-glocoprotein，P-gp)是一種由MDR1基因編碼的多藥耐藥相關(guān)蛋白，它是ATP依賴的藥物外排泵，能夠?qū)⒁呀?jīng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物排出細(xì)胞外，從而導(dǎo)致化療失敗。腫瘤細(xì)胞經(jīng)化療后能快速表達(dá)MDR1基因的mRNA，而小干擾RN

2、A(Small Interference RNA，siRNA)能引起同源目標(biāo)mRNA降解，從而導(dǎo)致特定基因表達(dá)沉默，因此，利用siRNA抑制MDR1基因mRNA的表達(dá)將是逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的可行手段。本研究擬篩選能有效抑制MDR1基因表達(dá)的siRNA，構(gòu)建帶有U6和H1雙啟動(dòng)子的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，制備siRNA表達(dá)載體的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，并與化療藥物聯(lián)用逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的多藥耐藥性，為siRNA藥物的研發(fā)和腫瘤多藥耐藥的基因治療奠定基礎(chǔ)。

3、r>　　方法:(1) siRNA序列的設(shè)計(jì):以人的MDR1基因（序列號(hào)NM_000927）為靶標(biāo)，根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)軟件得到大量siRNA備選序列，利用生物學(xué)信息學(xué)對(duì)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，并運(yùn)用BLAST進(jìn)行同源性分析，確定最終序列，由生物公司直接合成。(2)篩選有效的siRNA序列:將siRNA轉(zhuǎn)染入乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR中，分別在mRNA水平(Realtime PCR)和蛋白水平(Western Blot)對(duì)MDR1基因

4、的表達(dá)進(jìn)行定量分析，篩選高抑制效率的siRNA序列用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(3)對(duì)篩選出來(lái)的有效siRNA做進(jìn)一步的檢測(cè):MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性，Realtime PCR法做量效關(guān)系曲線，以確定其有效濃度范圍。(4)構(gòu)建siRNA表達(dá)載體:化學(xué)方法合成兩條與siRNA序列相對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)的單鏈DNA，兩端帶有HindⅢ和BglⅡ酶切位點(diǎn)，退火后與經(jīng)過HindⅢ和BglⅡ雙酶切的質(zhì)粒pDual進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)DH5

5、a，次日挑取單克隆菌落擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序鑒定。(5)制備siRNA表達(dá)載體的陽(yáng)離子脂質(zhì)體并對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)分析:將陽(yáng)離子脂、PEG化脂和膽固醇以一定比例混合，通過乙醇注入法制備空白脂質(zhì)體，將空白脂質(zhì)體和siRNA表達(dá)質(zhì)粒溶液等體積快速混合，向脂質(zhì)體內(nèi)主動(dòng)裝載核酸，得到siRNA質(zhì)粒的納米陽(yáng)離子脂質(zhì)體。測(cè)定脂質(zhì)體的電位、粒徑和包封率等物理參數(shù)，并對(duì)siRNA脂質(zhì)體的化學(xué)穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)，包括酶切穩(wěn)定性及血清穩(wěn)定性。(6) siRN

6、A質(zhì)粒脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究:利用Realtime PCR法建立siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體檢測(cè)的方法學(xué)，確定檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在此基礎(chǔ)上，對(duì)小鼠體內(nèi)質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)并求得半衰期。(7) siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體的體外藥效學(xué)研究:RealtimePCR法檢測(cè)乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體后MDR1基因的mRNA表達(dá)水平，SRB法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體后對(duì)阿霉素的敏感性。(8) siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體的體內(nèi)藥效學(xué)

7、研究:建立NOD SCID小鼠乳腺癌多藥耐藥模型，按腫瘤體積將動(dòng)物均衡分成三組，分別為空白對(duì)照組、阿霉素組、 siRNA脂質(zhì)體與阿霉素聯(lián)用組。尾靜脈注射給藥，間隔一周給藥一次，每天觀察小鼠狀態(tài)，隔天測(cè)腫瘤體積及動(dòng)物體重。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，全部小鼠處死并剝瘤，觀察腫瘤大小，稱瘤重并計(jì)算抑瘤率，同時(shí)用Realtime PCR檢測(cè)腫瘤組織中MDR1基因的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:(1) siRNA序列的設(shè)計(jì):根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)

8、MDR1基因的siRNA，并進(jìn)行mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)以及同源性分析后，得到8條siRNA序列。(2)篩選有效的siRNA序列:Realtime PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組無(wú)顯著差異;轉(zhuǎn)染siRNA4、siRNA5、siRNA6、siRNA8組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，沒有沉默MDR1基因的作用;陽(yáng)性對(duì)照組及轉(zhuǎn)染siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA7組MDR1表達(dá)水平分別下調(diào)63％(P＜0.05)、83％(P＜0.0001)

9、、68％(P＜0.0001)、68％(P＜0.01)、70％(P＜0.0001)，說(shuō)明這些siRNA序列能有效沉默MDR1基因。WesternBlot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA7組p-糖蛋白表達(dá)水平分別下調(diào)23％(P＜0.001)、45％(P＜0.001)、36％(P＜0.001)、37％(P＜0.001)、29％(P＜0.001)，說(shuō)明這些siRNA序列能有效抑制MDR1基因表達(dá)，

10、其中siRNA1的作用最明顯，備選用于下一步實(shí)驗(yàn)。(3)對(duì)篩選出來(lái)的siRNA1做進(jìn)一步的檢測(cè):MTT結(jié)果顯示，MCF-7/ADR+siRNA1組對(duì)阿霉素的敏感性明顯高于MCF-7/ADR組，差異具有顯著性（P＜0.05）。由低濃度到高濃度，細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性依次上調(diào)17％、45％、49％、42％、25％、1％。Realtime PCR量效關(guān)系曲線顯示，隨著siRNA1濃度的加大，沉默效率逐漸升高，最高抑制率為81.7％。(4)成功構(gòu)

11、建了siRNA表達(dá)載體，測(cè)序圖譜顯示表達(dá)載體中插入的DNA片段的基因序列與理論序列一致。(5) siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體的制備及理化性質(zhì)分析結(jié)果:成功制備siRNA表達(dá)質(zhì)粒的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，且脂質(zhì)體的粒徑及電位均符合要求，包封率高達(dá)88.32％。電泳結(jié)果表明質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體包裹后在DNaseⅠ及血清中的穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于裸質(zhì)粒，說(shuō)明質(zhì)粒經(jīng)包裹后得到了有效的保護(hù)。(6) siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體的藥代動(dòng)力學(xué)研究:根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作藥-時(shí)曲線并計(jì)算得出脂質(zhì)體包裹

12、的質(zhì)粒半衰期約為2h，而裸質(zhì)粒僅為6 min。(7) siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體的體外藥效學(xué)研究:Realtime PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組無(wú)顯著差異;在3μg和6μg劑量時(shí)，MDR1基因的mRNA表達(dá)水平分別下調(diào)33％(P＜0.01)和76％(P＜0.01)，說(shuō)明siRNA1質(zhì)粒脂質(zhì)體能有效的沉默MDR1基因。SRB結(jié)果顯示，MCF-7/ADR組與NC組細(xì)胞抑制率無(wú)顯著性差異;MCF-7/ADR+siRNA1質(zhì)粒脂質(zhì)體組抑制

13、率明顯高于MCF-7/ADR組及NC組，具有顯著性差異(P＜0.05)。由低濃度到高濃度，細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性依次上調(diào)10％、6％、14％、23％、44％、28％。(8) siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體的體內(nèi)藥效學(xué)研究:成功建立了NOD SCID小鼠乳腺癌多藥耐藥模型。分析整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程測(cè)量的小鼠體重和腫瘤體積數(shù)據(jù)，從小鼠體重方面看，給藥后與對(duì)照組相比，各組體重均有所減輕，尤其是siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體+阿霉素給藥組，但各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從腫瘤體

14、積方面看，與對(duì)照組相比，阿霉素組無(wú)顯著性差異;siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體與阿霉素聯(lián)用組顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)（P＜0.05）。剝瘤后對(duì)瘤重的分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，阿霉素組無(wú)顯著性差異;siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體與阿霉素聯(lián)用組顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)(P＜0.05)，且抑瘤率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于阿霉素組。Realtime PCR檢測(cè)腫瘤組織中MDR1基因的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，阿霉素組無(wú)顯著性差異;siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體與阿霉素聯(lián)用組MDR1基因的表達(dá)

15、水平下調(diào)53％(P＜0.01)。
　　結(jié)論:(1)成功設(shè)計(jì)篩選出4個(gè)能有效抑制MDR1基因表達(dá)的siRNA靶點(diǎn)，其中siRNA1干擾效率最高。(2)成功構(gòu)建了靶向MDR1基因的siRNA表達(dá)載體pDual-siRNA1，并制備了siRNA表達(dá)載體的陽(yáng)離子脂質(zhì)體。(3)siRNA1及其質(zhì)粒脂質(zhì)體能有效地沉默MDR1基因，siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體與化療藥物聯(lián)用后能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞和腫瘤的生長(zhǎng)，很大程度上逆轉(zhuǎn)乳腺癌的多藥耐藥。(4)納米陽(yáng)