干擾FZD1逆轉(zhuǎn)Wnt-β-catenin通路介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥的研究.pdf

1、研究背景：
　　 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，且發(fā)病率仍在不斷升高，嚴(yán)重危害世界女性健康。作為對化療比較敏感的實體瘤之一，化療是其不可替代的治療手段，然而乳腺癌多藥耐藥的出現(xiàn)成為導(dǎo)致乳腺癌化療失敗的重要原因。多藥耐藥也稱交叉耐藥，即腫瘤對一系列結(jié)構(gòu)、靶點和作用機制不同的藥物均產(chǎn)生耐藥性，其發(fā)生涉及多重機制。MDR1基因編碼的P-糖蛋白(MDR1/P-gp)，作為ATP結(jié)合盒膜轉(zhuǎn)運蛋白超家族的成員，可通過水解ATP獲得能量將進入

2、細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出，降低藥物的濃度及毒性，介導(dǎo)多種腫瘤的多藥耐藥。
　　 P-糖蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥約占乳腺癌多藥耐藥的55％，因此對MDR1/P-gp進行干預(yù)成為逆轉(zhuǎn)乳腺癌的化療耐藥的重要途徑。盡管已開發(fā)了多種針對MDR1/P-gp的抑制劑及調(diào)節(jié)劑，但治療濃度的毒性及副作用限制了其應(yīng)用；免疫學(xué)治療、中藥等天然藥物治療以及基因治療也未能完全逆轉(zhuǎn)耐藥。近年的臨床前研究中基于調(diào)控P-糖蛋白轉(zhuǎn)錄的信號通路的分子靶向治療嶄露頭角。
　

3、　 Yamada等在結(jié)腸癌中的研究表明，人類MDR1基因啟動子區(qū)包含多個Tcf4/LEF結(jié)合基序，MDR1是β-catenin/Tcf4/LEF轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的直接靶基因，抑制Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路可下調(diào)MDR1的表達。Wnt/β-catenin信號通路對多種腫瘤發(fā)生發(fā)展均起重要調(diào)控作用，其中包括乳腺癌。β-catenin蛋白是通路的核心，Wnt信號蛋白與膜表面的Frizzled受體結(jié)合使通路活化，大量β-catenin進

4、入細(xì)胞核內(nèi)，與TCF/LEF結(jié)合形成β-catenin/TCF/TEF轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。
　　 研究者已發(fā)現(xiàn)Wnt蛋白的受體Frizzled(FZD)1/2在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中過表達，作為Wnt/β-catenin通路必不可少的組成元件，其表達的改變可影響通路的調(diào)控。近年有報道證實，F(xiàn)ZD1在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中可通過激活Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控MDR1的表達影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤化療耐藥。
　　

5、我們檢測了FZD1在乳腺癌敏感細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231以及多藥耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM中的表達，發(fā)現(xiàn)其在多藥耐藥的ADM細(xì)胞中無論mRNA水平還是蛋白水平均顯著高于敏感株。對敏感株給予不同濃度阿霉素進行誘導(dǎo)，72h后檢測FZD1及MDR1 mRNA水平的表達，發(fā)現(xiàn)在低至中濃度阿霉素誘導(dǎo)下二者均明顯升高，提示FZD1及Wnt/β-catenin通路在乳腺癌細(xì)胞獲得性多藥耐藥的發(fā)生發(fā)展中的潛在作用。因此在本研究中我們設(shè)計小干擾

6、RNA(siRNA)載體轉(zhuǎn)染乳腺癌耐藥細(xì)胞后沉默F(xiàn)ZD1以期下調(diào)MDR1/P-gp的表達、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性并探討Wnt/β-catenin通路在其中的調(diào)控作用。
　　 研究方法：
　　 1.分別用RT-PCR及Western blot方法檢測實驗室培養(yǎng)的3種乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231以及多藥耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM中FZD1及MDR1基因的表達情況。并分別將敏感細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231轉(zhuǎn)染含

7、MDR1全長cDNA序列的載體SF91m3PRE以獲得耐藥細(xì)胞MCF-7/MDR、MDA-MB-231/MDR。
　　 2.敏感細(xì)胞MCF-7及MDA-MB-231分別給予濃度為0，0.2，1，5μM的阿霉素作用72h后提取細(xì)胞總RNA進行實時熒光定量PCR檢測FZD1及MDR1 mRNA水平表達的改變。
　　 3.分別設(shè)計并合成針對FZD1基因的雙鏈干擾RNA序列以及作為對照的非靶向性干擾序列，將其定向插入到質(zhì)粒載體p

8、SUPER.neo+GFP中，構(gòu)建穩(wěn)定表達載體pSUPER-siFZD1和pSUPER-siNotarget。酶切及測序鑒定正確后，大量擴增。
　　 4.上述干擾質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)染3種多藥耐藥細(xì)胞中，培養(yǎng)48h后，通過RT-PCR檢測各組細(xì)胞中FZD1 mRNA和MDR1 mRNA的表達情況，應(yīng)用Western blot檢測FZD1蛋白和P-糖蛋白表達情況，應(yīng)用羅丹明外排實驗流式細(xì)胞術(shù)檢測P-糖蛋白外排功能，應(yīng)用MTT法檢測各組細(xì)

9、胞對阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶和順鉑的半數(shù)細(xì)胞抑制濃度(IC50)及相對耐藥指數(shù)(RR)的改變，評價FZD1干擾對細(xì)胞多藥耐藥性的影響。分別提取細(xì)胞漿蛋白及核蛋白，應(yīng)用Western blot方法檢測胞漿及胞核中β-catenin蛋白的表達情況，揭示W(wǎng)nt/β-catenin通路在其中的調(diào)控作用。
　　 5.對轉(zhuǎn)染后的ADM siFZD1細(xì)胞以G418篩選培養(yǎng)出穩(wěn)定表達細(xì)胞后再轉(zhuǎn)染MDR1全長載體SF91m3PRE，觀察由FZ

10、D1干擾所致的耐藥性改變能否被逆轉(zhuǎn)。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1.對本實驗室培養(yǎng)的3種乳腺癌細(xì)胞系檢測發(fā)現(xiàn)FZD1在耐藥細(xì)胞ADM中無論mRNA水平還是蛋白水平均較2種敏感細(xì)胞明顯升高，而MDR1/P-gp僅在ADM細(xì)胞中高表達，敏感株幾乎不表達。
　　 2.MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)阿霉素誘導(dǎo)后檢測發(fā)現(xiàn)，在MCF-7細(xì)胞中，低中濃度(0.2μM，1μM)阿霉素作用下FZD1及MDR1 mRNA水平均

11、呈濃度依賴性升高；在致死劑量(5μM)作用下，F(xiàn)ZD1水平下降而MDR1繼續(xù)升高；MDA-MB-231細(xì)胞中，F(xiàn)ZD1及MDR1水平則一直呈濃度依賴性升高。
　　 3.轉(zhuǎn)染48h后，應(yīng)用半定量RT-PCR檢測各組細(xì)胞中FZD1和MDR1 mRNA水平的表達情況，結(jié)果顯示：與轉(zhuǎn)染非靶向性siRNA的對照組相比，F(xiàn)ZD1干擾組的FZD1及MDR1 mRNA水平均明顯降低。Western blot檢測結(jié)果表明FZD1干擾組細(xì)胞2種蛋白

12、的表達水平均明顯降低，而胞漿及胞核中β-catenin蛋白也較對照組有明顯降低。羅丹明外排實驗顯示，耐藥細(xì)胞中羅丹明熒光含量均遠(yuǎn)低于對應(yīng)的敏感細(xì)胞，而FZD1干擾后熒光含量與對照組相比均顯著升高，熒光強度曲線峰值明顯右移，P-gp外排功能降低。MTT法檢測細(xì)胞對4種化療藥物的耐受性，發(fā)現(xiàn)FZD1干擾組細(xì)胞對阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶和順鉑的IC50明顯降低，相對耐藥指數(shù)顯著下降，耐藥性被不同程度逆轉(zhuǎn)。而ADM siFZD1穩(wěn)定表達細(xì)胞

13、轉(zhuǎn)染SF91m3PRE重新過表達MDR1后這一逆轉(zhuǎn)又被顛覆，敏感性再次下降，證明FZD1干擾后發(fā)生的上述耐藥性改變確為下調(diào)MDR1所致。
　　 結(jié)論：
　　 1.FZD1與MDR1在乳腺癌多藥耐藥細(xì)胞中均呈高表達且阿霉素誘導(dǎo)可致二者均升高，提示FZD1與MDR1介導(dǎo)的獲得性多藥耐藥相關(guān)。干擾FZD1可以抑制MDR1的表達，從而顯著降低細(xì)胞多藥耐藥性。
　　 2.干擾FZD1后細(xì)胞漿、細(xì)胞核中β-catenin蛋白