間充質(zhì)干細(xì)胞通過Wnt-β-catenin通路促進(jìn)人膽管癌細(xì)胞增殖、侵襲和耐藥的研究.pdf

1、膽管癌(Cholangiocarcinoma)是指原發(fā)于左右肝管匯合部至膽總管下端的肝外膽管惡性腫瘤，膽管癌的發(fā)生率逐年增高，但由于缺乏特異性的臨床表現(xiàn)和診斷指標(biāo)，早期診斷率低下，目前尚缺乏有效治療于段?，F(xiàn)階段的臨床應(yīng)用藥物對膽管癌敏感性欠佳，且存在明顯毒副作用，因此深入了解膽管癌的發(fā)病和耐藥機(jī)制，尋求更敏感、有效的藥物，對提高膽管癌藥物治療的療效十分必要。Compound K(20-O-beta-D-glucopyranosyl-20

2、(S)-protopanaxadiol,CK），是二醇型人參皂甙在腸道細(xì)菌作用下的最終代謝產(chǎn)物。我們前期研究證實，CK對胃癌、肝癌、腸癌、膽管癌等多種腫瘤具有很好的抑制作用。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstem cells，MSCs)是具有多向分化潛能的非造血干細(xì)胞，除了具有造血支持、免疫調(diào)節(jié)和多向分化等特性外，還具有特異性地遷移到損傷部位和腫瘤組織的特性，繼而對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起調(diào)控作用。目前的研究表明，MSCs對不同的腫瘤細(xì)胞

3、或同一種腫瘤細(xì)胞可能起不同的調(diào)控作用。本課題是在抗癌藥物CK干預(yù)下，研究MSCs對膽管癌細(xì)胞增殖、侵襲和耐藥的影響及其作用機(jī)制。
　　 本研究是通過膠原酶消化法在人臍帶中成功分離、純化了MSCs。以人膽管癌細(xì)胞系QBC939、Mz-Cha-1及裸鼠荷膽管癌模型為研究對象，采用直接共培養(yǎng)、間接共培養(yǎng)、以及收集MSCs條件培養(yǎng)基(Condition Medium，CM)等方法作用于研究對象。首先，通過MTS法測定了兩種細(xì)胞系在CM存

4、在和不存在兩種情況下經(jīng)不同濃度CK的處理24 h后細(xì)胞的增殖存活率。結(jié)果表明，CK對QBC939和Mz-Cha-1細(xì)胞具有明顯的存活抑制作用，它們的增殖存活率與CK呈劑量-時間依賴關(guān)系。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)當(dāng)有CM存在的情況下，CK的作用減弱。比較兩組最高濃度CK的抑制率發(fā)現(xiàn)CM組CK的抑制率小于對照組(p＜0.05)，說明CM可以在一定程度上拮抗CK的抗癌作用，提高膽管癌細(xì)胞對CK的耐受性。隨后，通過Annexin V/PI雙染，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢

5、測得到了相似的結(jié)果，CM能夠減弱CK的誘導(dǎo)QBC939和Mz-Cha-1細(xì)胞的凋亡。同時，我們還采用了Transwell和克隆形成的方法檢測了MSCs對QBC939和Mz-Cha-1細(xì)胞的侵襲和克隆形成能力，結(jié)果顯示，CK可有效抑制QBC939和Mz-Cha-1細(xì)胞的侵襲和克隆形成，但這一抑制現(xiàn)象也被MSCs在一定程度上逆轉(zhuǎn)。
　　 為了進(jìn)一步闡明MSCs促進(jìn)QBC939和Mz-Cha-1細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和逆轉(zhuǎn)CK作用的分子機(jī)

6、制，我們首先采用熒光素酶雙報告基因的方法檢測MSCs對Wnt活性的影響，結(jié)果證明MSCs對Wnt活性有顯著的激活作用(p＜0.01)，而CK則能明顯拮抗MSCs對Wnt的激活(p＜0.05)。接著，我們用Western Blotting的方法對經(jīng)不同處理組的QBC939和Mz-Cha-1細(xì)胞全蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果表明CM能夠促進(jìn)QBC939和Mz-Cha-1兩種細(xì)胞系的β-catenin蛋白表達(dá)增加，β-catenin的下游靶蛋白MMP2

7、，c-Myc的表達(dá)也被上調(diào)。綜合前面Wnt活性測定結(jié)果，提示我們CM促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移可能是通過Wnt/β-catenin途徑。因此，我們繼續(xù)采用免疫熒光和分離細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白經(jīng)WesternBlotting分析相結(jié)合的方法研究CM對β-catenin在膽管癌細(xì)胞內(nèi)亞定位影響。結(jié)果顯示，在QBC939和Mz-Cha-1細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin受CM影響轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，從而使細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin增多，繼而調(diào)控下游的

8、增殖轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白，促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移。另外，我們還通過膽管癌芯片分析了40例人膽管癌組織中β-catenin以及c-Myc的表達(dá)。分析發(fā)現(xiàn)，c-Myc的表達(dá)與年齡、腫瘤病理分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均無相關(guān)性，而β-catenin與其中的腫瘤病理分期有相關(guān)性，腫瘤分期越高，β-catenin表達(dá)越高。這一結(jié)果提示我們β-catenin在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的作用，為我們接下來的研究提供了有力的依據(jù)。
　　

9、 最后，我們采用裸鼠皮下成瘤模型，結(jié)果證實MSCs及其條件培養(yǎng)基可以在裸鼠體內(nèi)有效的促進(jìn)QBC939細(xì)胞的增殖生長，且促進(jìn)其向肝臟轉(zhuǎn)移。免疫組化對裸鼠移植瘤組織分析，得出，MSCs組的β-catenin，cyclinD1，和KI-67的表達(dá)較對照組有明顯增多。CK同樣在體內(nèi)有效抑制了膽管癌細(xì)胞QBC939細(xì)胞的增殖生長和肝轉(zhuǎn)移。綜上所述，本論文的研究結(jié)果證實了MSCs及其條件培養(yǎng)基具有促進(jìn)人膽管癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的能力和對抗癌藥物CK