人類臍帶間充質干細胞阻抑肝內膽管癌細胞生長的分子機制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　肝內膽管細胞癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)，又被稱為外周型膽管癌，或者膽管癌之肝內型，它是肝內膽管被覆上皮發(fā)生的，并起源于肝內二級分支以下膽管上皮的原發(fā)性肝癌的其中一種類型，據世界范圍內統(tǒng)計，ICC約占原發(fā)性肝臟所發(fā)生惡性腫瘤的10％-15％，其發(fā)生率僅次于肝細胞癌(HCC)，但近年來已經上升為肝內原發(fā)腫瘤導致死亡的第一位，目前認為，肝內膽管癌的發(fā)生與膽管結石、乙

2、型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎感染以及其他膽管發(fā)生的炎癥等因素密切相關。肝內膽管癌具有發(fā)生隱匿、臨床癥狀不典型、惡性程度高、發(fā)展迅速、容易轉移等特點，盡管目前在早期診斷和治療方法上有了很大改進，但是仍不能改變其不良預后，因此發(fā)現新的、有效的抗肝內膽管癌的方法是當務之急。隨著廣大研究者對腫瘤分子機制不斷的深入認識，現在已將惡性腫瘤定義為一種多因子、多步驟和多基因參與的全身性疾病，因此，在近10年中，腫瘤的生物學治療以及基因治療成為腫瘤治療的

3、研究熱點和新希望。
　　間充質干細胞(MSCs)是干細胞的一種類型，因其能分化成間質組織而得名，MSCs是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞，在特定的誘導環(huán)境下，可進一步分化為骨、軟骨、脂肪、肌腱、肌肉等組織，目前，MSCs已被廣泛應用于細胞治療及組織再生方面的研究。人臍帶來源的間充質干細胞因較其他來源的干細胞具有更明顯的優(yōu)勢，所以越來越受到人們的重視，研究表明，人臍帶組織中分離得到的間充質干細胞既具有較強的增殖能力，又具有向其

4、它類型細胞（神經元樣細胞、少突膠質細胞、脂肪細胞及星形膠質細胞等）分化的能力，加之其來源廣泛、易獲得且具有較強的腫瘤趨化能力等特點，在細胞移植及基因治療、組織工程等方面具有廣闊的應用前景。因干細胞強的腫瘤趨化能力，很多研究者聚焦于其與腫瘤細胞之間的關系，干細胞移植技術已應用于幾種造血及非造血腫瘤的治療，將干細胞應用于腫瘤治療具有廣泛的前景，有研究證實，某些實體腫瘤的生長可被干細胞所抑制，另有研究顯示，這種抑制作用是通過于細胞自身分泌的可

5、溶性活性因子實現的。
　　但是，目前尚沒有關于間充質干細胞對肝內膽管癌細胞作用研究的相關報道，因此本研究對此作用及其分子機制進行了初步探討。本研究通過Transwell共培養(yǎng)實驗、MTT比色實驗、DNA斷裂實驗等方法，檢測臍帶間充質干細胞對肝內膽管癌HCCC-9810細胞增殖和凋亡的影響，同時借助于WesternBlot及免疫熒光染色方法，檢測與肝內膽管癌發(fā)生發(fā)展密切相關通路中蛋白質表達水平的變化，進一步探討臍帶間充質干細胞作用于

6、肝內膽管癌細胞生長可能的分子機制。
　　第一部分:人類臍帶間充質干細胞對肝內膽管癌細胞生長的影響
　　研究目的:
　　1、檢測人類臍帶間充質干細胞對肝內膽管癌HCCC-9810細胞生長的影響。
　　2、檢測不同濃度人類臍帶間充質干細胞條件培養(yǎng)基對肝內膽管癌HCCC-9810細胞生長的影響。
　　3、檢測人類臍帶間充干細胞條件培養(yǎng)基對肝內膽管癌HCCC-9810細胞生長的影響是否由誘導HCCC-9810細胞凋

7、亡所介導。
　　4、檢測人類臍帶間充質干細胞及其條件培養(yǎng)基對裸鼠肝內膽管癌移植瘤生長的影響。
　　研究方法:
　　1、采用transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)共培養(yǎng)人類臍帶間充質干細胞（HUVECs細胞作為對照）與HCCC-9810細胞，應用細胞計數法計數處理后的腫瘤細胞數。
　　2、配置不同濃度的干細胞條件培養(yǎng)基(10％、25％、50％、75％)處理HCCC-9810細胞，應用MTT細胞增殖實驗及細胞克隆實驗測定HCC

8、C-9810細胞增殖率的變化。
　　3、應用Hoechst33258染色實驗檢測干細胞條件培養(yǎng)基誘導HCCC-9810細胞凋亡的作用。
　　4、采用皮下注射細胞懸液的方法，構建裸鼠移植瘤模型，測量注射不同細胞組間腫瘤發(fā)生率及體積大小，并采用臍帶間充質干細胞條件培養(yǎng)基注射于已形成腫瘤部位的方法，測量腫瘤體積的變化。
　　5、采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件用于實驗數據的統(tǒng)計學分析，數據的統(tǒng)計學意義通過獨立組間學生t檢驗，采用

9、((x)±S)進行分析。
　　結果:
　　1、臍帶間充質干細胞對肝內膽管癌HCCC-9810細胞增殖的影響
　　HCCC-9810細胞與hUC-MSCs細胞共培養(yǎng)48h后，計數細胞為7.64×105個/ml，而與HUVECs細胞共培養(yǎng)48h后，細胞計數為11.98×105個/ml，由此可見，臍帶間充質干細胞誘導的HCCC-9810腫瘤細胞抑制效應明顯高于HUVECs對照組，與對照組相比，腫瘤細胞增殖率下降了34.4％，

10、差異具明顯的統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。為了進一步檢測培養(yǎng)的臍帶間充質干細胞微環(huán)境是否能抑制腫瘤細胞的生長，我們檢測了干細胞條件培養(yǎng)基對HCCC-9810細胞增殖的影響，結果顯示，HCCC-9810細胞經不同濃度間充質干細胞條件培養(yǎng)液處理后，細胞增殖抑制率呈現時間與劑量依賴性，HCCC-9810細胞經50％間充質干細胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后，增殖抑制率由6.21％增至49.86％，與對照組相比有顯著差距。我們又采用了細胞克隆實驗進一步

11、證實這種抑制作用的存在，結果顯示，與對照組相比，臍帶間充質干細胞條件培養(yǎng)基處理組細胞克隆單位形成數明顯低于對照組(p＜0.01)。
　　2、臍帶間充質干細胞條件培養(yǎng)液對HCCC-9810細胞凋亡的影響
　　為了證實干細胞條件培養(yǎng)基對HCCC-9810細胞的增殖抑制是否由凋亡介導，進一步采用DNA染色的方法觀察核染色質形態(tài)。結果顯示，HCCC-9810細胞經50％臍帶間充質干細胞條件培養(yǎng)液處理48h后，經Hoechst3325

12、8染色呈現明顯細胞凋亡，凋亡細胞比率明顯高于對照組，與對照組相比，差異具明顯的統(tǒng)計學意義(p＜0.05VS.HUVEC對照組)。
　　3、臍帶間充質干細胞抑制BALB/C裸鼠移植瘤的形成
　　結果顯示，皮下注射不同細胞組50天后，注射HCCC-9810+MSC細胞組，移植瘤出現時間及腫瘤體積均明顯低于對照組:觀察至第35-40天，有7只裸鼠長出可視腫瘤（觀察至第50天，平均腫瘤體積約為1.3cm3），此組中另外3只裸鼠始終無

13、腫瘤發(fā)生。注射HCCC-9810細胞組，或者HCCC-9810+HUVEC細胞組中所有實驗小鼠均形成了可視腫瘤（觀察至第50天，平均腫瘤體積分別為2.6cm3，2.5cm3）。實驗的50-70天，分別給HCCC-9810實驗組繼續(xù)注射間充質干細胞或者HUVECs細胞的條件培養(yǎng)基，結果顯示，注射間充質干細胞條件培養(yǎng)基組，原本已形成的腫瘤體積明顯縮小，至實驗結束，干細胞條件培養(yǎng)基處理組小鼠腫瘤的平均體積降至1.4cm3，而對照組腫瘤體積繼續(xù)

14、增長至3.5cm3，差異具顯著的統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　1、臍帶間充質干細胞可抑制肝內膽管癌HCCC-9810細胞的生長。
　　2、經50％臍帶間充質干細胞條件培養(yǎng)基處理肝內膽管癌HCCC-9810細胞24小時可達到細胞的半數抑制率。
　　3、臍帶間充質干細胞可抑制BALB/C裸鼠移植瘤的形成，且其條件培養(yǎng)基可使已形成的腫瘤體積縮小。
　　4、臍帶間充質干細胞對肝內膽管癌HCCC-9810細胞生長的抑

15、制作用是通過誘導細胞凋亡所介導的。
　　第二部分:人類臍帶間充質干細胞阻抑肝內膽管癌細胞生長的分子機制
　　研究目的:
　　1、檢測經臍帶間充質干細胞條件培養(yǎng)基作用后，肝內膽管癌HCCC-9810細胞中PI3K/Akt信號轉導通路主要蛋白的表達水平變化。
　　2、檢測經臍帶間充質干細胞條件培養(yǎng)基作用后，肝內膽管癌HCCC-9810細胞中Wnt/β-catenin信號轉導通路主要蛋白的表達水平變化。
　　3、

16、檢測加入GSK-3β的抑制劑或者激活劑，或加入Akt激活劑，作為單一處理因素，或者聯(lián)合臍帶間充質干細胞條件培養(yǎng)基處理HCCC-9810細胞，所介導的肝內膽管癌細胞增殖及相關蛋白的變化。
　　研究方法:
　　1、Western Blot方法檢測肝內膽管癌HCCC-9810細胞經臍帶間充質干細胞條件培養(yǎng)基處理前后p-PI3K、p-PDK1、p-Akt、Akt、p-GSK-3β、GSK-3β、β-Catenin、c-Myc、Cyc

17、linD1等蛋白的表達變化。
　　2、細胞免疫熒光染色方法檢測肝內膽管癌HCCC-9810細胞經臍帶間充質干細胞條件培養(yǎng)基處理前后p-Akt、p-GSK-3β、β-Catenin的表達變化。
　　3、分別加入GSK-3β特異性激活試劑SNP及特異性抑制試劑CHIR99021作為單一處理因素，或者與臍帶間充質干細胞條件培養(yǎng)基聯(lián)合作用后，觀察肝內膽管癌HCCC-9810細胞增殖能力變化，并進一步檢測β-Catenin的表達變化。

18、
　　4、加入Akt特異性激活劑IGF-1預處理HCCC-9810細胞15min后，進一步觀察臍帶間充質干細胞條件培養(yǎng)基對肝內膽管癌HCCC-9810細胞增殖能力的影響。
　　結果:
　　1、hUC-MSCs條件培養(yǎng)基可抑制肝內膽管癌HCCC-9810細胞中PI3K/Akt信號轉導通路相關蛋白的表達
　　1)Western Blot實驗結果顯示，HCCC-9810細胞經50％hUC-MSCs條件培養(yǎng)基處理48小時

19、后，與對照組相比，p-PI3K、p-PDK1、p-Akt、p-GSK-3β的表達明顯下調，而總的Akt(T-Akt)與總的GSK-3β(T-GSK-3β)的表達無明顯變化，而HUVEC條件培養(yǎng)基處理組上述蛋白表達與空白對照組相比無明顯變化。統(tǒng)計顯示，HUVEC條件培養(yǎng)基處理組與hUC-MSC條件培養(yǎng)基處理組相比，p-Akt與T-Akt的灰度比值分別為0.65±0.04及0.19±0.02(P＜0.001)，p-GSK-3β與T-GSK-

20、3β的灰度比值分別為0.48±0.03及0.22±0.05(P＜0.01)，比值差異均具有明顯的統(tǒng)計學意義。
　　2)細胞免疫熒光染色結果顯示，與空白對照組相比，干細胞條件培養(yǎng)基處理組p-Akt、p-GSK-3β的相對熒光強度分別為37.3±0.8％、35.7±1.2％，空白對照組p-Akt、p-GSK-3β的蛋白熒光強度明顯高于干細胞條件培養(yǎng)基處理組，兩組間差異的統(tǒng)計學意義較顯著(P＜0.01，p-Akt;P＜0.01，p-GS

21、K-3β)。
　　2、hUC-MSCs條件培養(yǎng)基可抑制肝內膽管癌HCCC-9810細胞中Wnt信號轉導通路相關蛋白的表達
　　1)Western Blot實驗結果顯示，肝內膽管癌HCCC-9810細胞經50％hUC-MSCs條件培養(yǎng)基處理48小時后，與空白對照組相比，β-catenin、c-Myc、cyclin-D1的表達明顯下調，并且β-catenin的核富集量明顯減少，而HUVEC條件培養(yǎng)基處理組β-catenin、c-

22、Myc、cyclin-D1的蛋白表達情況幾乎與空白對照組相似。
　　2)細胞熒光免疫染色結果顯示，干細胞條件培養(yǎng)基處理組β-catenin在細胞核中熒光強度較空白對照組明顯減弱。
　　3、hUC-MSCs條件培養(yǎng)基通過Akt通路調節(jié)GSK-3β的活性，從而下調β-catenin的表達，抑制Wnt通路
　　經GSK-3β抑制劑(CHIR99021)處理后，48h觀察點結果顯示，CHIR99021與hUC-MSCs條件培養(yǎng)

23、基聯(lián)合處理組與hUC-MSCs條件培養(yǎng)基單獨處理組相比，HCCC-9810細胞的抑制作用明顯減弱(p＜0.001)，并且CHIR99021與hUC-MSCs條件培養(yǎng)基聯(lián)合處理組增加了β-catenin的蛋白表達水平。而經GSK-3β激活劑(SNP)處理后，48h觀察點結果顯示，SNP與hUC-MSCs條件培養(yǎng)基聯(lián)合處理組與hUC-MSCs條件培養(yǎng)基單獨處理組相比，HCCC-9810細胞的抑制作用明顯增強(p＜0.001)，并且SNP與h

24、UC-MSCs條件培養(yǎng)基聯(lián)合處理組下調了β-catenin的蛋白表達水平。加入Akt通路激活劑IGF-1預處理HCCC-9810細胞15min后，24h觀察點結果顯示，IGF-1與hUC-MSCs條件培養(yǎng)基聯(lián)合處理組與hUC-MSCs條件培養(yǎng)基單獨處理組相比，IGF-1與hUC-MSCs條件培養(yǎng)基聯(lián)合處理組對HCCC-9810細胞的抑制作用明顯下降(p＜0.05）。
　　結論:
　　1、hUC-MSCs條件培養(yǎng)基可通過抑制P