MDR1啟動子靶向的雙自殺基因?qū)δ退幇籽〖?xì)胞殺傷作用的實驗研究.pdf

1、目的：構(gòu)建多藥耐藥基因(MDR1)啟動子靶向的CD-TK雙自殺基因高表達(dá)載體，觀察其對耐藥白血病細(xì)胞K562-A02細(xì)胞的選擇性殺傷作用，探討耐藥白血病的靶向性基因治療。 方法：采用PCR方法從K562-A02細(xì)胞基因組DNA擴(kuò)增多藥耐藥MDR1啟動子片段，并在其兩端分別連接NdeⅠ和HindⅢ酶切位點，插入到具有相同酶切位點的pcDNA3-TK質(zhì)粒中自殺基因TK的上游，通過電泳及DNA測序證實連接準(zhǔn)確。獲得含正確目的基因的表達(dá)

2、載體pcDNA3-MDR1-Promoter-TK。用BamHⅠ單酶切pcDNA3-MDR1-Promoter-TK及pcDNA3-CD-TK，通過基因重組技術(shù)將CD基因連接到TK基因的上游，通過電泳及DNA測序證實連接準(zhǔn)確。獲得含正確目的基因的表達(dá)載體pcDNA3-MDR1-Promoter-CD-TK。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)入白血病細(xì)胞系K562-A02和K562細(xì)胞中，通過G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。RT-PCR鑒定

3、TK、CD基因的表達(dá)，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞做對照，加用不同濃度的GCV、5-FC培養(yǎng)4天，MTT法測定細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果：PCR擴(kuò)增所得MDR1啟動子片段的長度和序列通過電泳及DNA測序得到證實，采用PCR擴(kuò)增及DNA測序證實pcDNA3-TK質(zhì)粒中插入的MDR1啟動子大小、位置及方向均正確。經(jīng)限制性內(nèi)切酶單酶切pcDNA3-CD-TK獲得1.3KbCD基因，通過基因重組技術(shù)成功將其插入同樣酶切后的pcDNA3

4、-MDR1-Promoter-TK質(zhì)粒TK基因的上游，采用PCR擴(kuò)增及DNA測序證實插入的CD基因的大小、位置及方向正確。成功構(gòu)建含正確目的基因的表達(dá)載體pcDNA3-MDR1-Promoter-CD-TK。經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入K562、K562-A02細(xì)胞內(nèi)，RT-PCR鑒定CD、TK基因在多藥耐藥細(xì)胞株K562-A02中得到了表達(dá)，而敏感株不表達(dá)。加入GCV、5-FC后耐藥白血病細(xì)胞較不耐藥的白血病細(xì)胞有明顯的殺傷效果，細(xì)胞存活率下降，聯(lián)