CMVE-pCEA嵌合啟動子驅(qū)動的雙自殺基因HSV-TK-CD對不同CEA表達(dá)水平的肺癌細(xì)胞系的體外殺傷作用研究.pdf

1、廣州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文CMVE-pCEA嵌合啟動子驅(qū)動的雙自殺基因HSV-TK/CD對不同CEA表達(dá)水平的肺癌細(xì)胞系的體外殺傷作用研究姓名：彭桂林申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：外科學(xué)（胸外科）指導(dǎo)教師：何建行20090501廣州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文傷作用的差異以及雙自殺基因的協(xié)同化作用。注：本課題來源于國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( 3 0 4 7 1 9 9 7 )目的：通過雙自殺基因H S V —T K ／C D 轉(zhuǎn)染不同C E A 表達(dá)水平的

2、肺癌細(xì)胞系并進(jìn)行體外殺傷作用的觀察，確定該系統(tǒng)的靶向性啟動及雙自殺基因表達(dá)后化療前體藥物G C V 和5 一F C 對肺癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)和協(xié)同作用，為進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。方法：使用免疫組化，普通R T - P C R 及熒光定量R T —P C R 的方法鑒定A 5 4 9 ，S P C —A 一1 ，N C I —H 5 2 0 ，1 6 H B E 細(xì)胞有無C E A 的表達(dá)及表達(dá)量的差異。然后以E G F P 為觀察對象，使

3、用脂質(zhì)體2 0 0 0 ，通過條件優(yōu)化，獲得各細(xì)胞的最優(yōu)轉(zhuǎn)染效率，并以此最優(yōu)效率進(jìn)行目的基因的轉(zhuǎn)染。把已成功構(gòu)建并經(jīng)測序鑒定的重組質(zhì)粒C M V E —p C E A - I R E S —E G F P 轉(zhuǎn)染到不同C E A 表達(dá)水平的肺癌細(xì)胞A 5 4 9 ，S P C - A - I ，N C I —H 5 2 0 ，1 6 H B E 中，觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，確定C E A 啟動子的靶向性。然后把含有雙自殺基因的載體C M

4、V E - p C E A - T K —I R E S - C D 轉(zhuǎn)染到C E A 陽性的A 5 4 9 ，S P C - A 一1 細(xì)胞中，經(jīng)G 4 1 8 篩選獲得穩(wěn)定的抗性克隆，并用熒光定量P C R 檢測轉(zhuǎn)染載體后的A 5 4 9 ／T K + C D ，S P C —A 一1 ／T K + C D 細(xì)胞m R N A 中T K ，C D 基因的表達(dá)量。W S T —l 法檢測前體藥物單一或聯(lián)合應(yīng)用對轉(zhuǎn)染細(xì)胞A 5 4 9

5、／T K + C D ，S P C _ A 一1 ／T K + C D的殺傷作用。另外，按不同比例分別混合A 5 4 9 ／T K + C D 和A 5 4 9 細(xì)胞，S P C —A 一1 ／T K + C D 和S P C —A 一1 細(xì)胞，藥物干預(yù)下觀察旁觀者效應(yīng)。用流式細(xì)胞儀檢測不同藥物濃度下單一或聯(lián)合用藥時細(xì)胞的凋亡和周期改變情況，用電鏡觀察藥物干預(yù)下的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果：免疫組化，R T —P C R 及熒光定量P C

6、R 檢測發(fā)現(xiàn)A 5 4 9 及S P C —A - l 細(xì)胞為C E A陽性細(xì)胞，而N C I —H 5 2 0 ，1 6 H B E 細(xì)胞為C E A 陰性細(xì)胞，且A 5 4 9 細(xì)胞的C E A 表達(dá)量要明顯高于S P C —A 一1 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染C M V E - p C E A - I R E S - E G F P 后，E G F P 的表達(dá)量與肺癌細(xì)胞內(nèi)C E A 表達(dá)水平相關(guān)。各肺癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率均能達(dá)到7 0 5 或以上

7、，陰性對照的1 6 H B E 則為5 4 ％。嵌合啟動子C M V E - p C E A 調(diào)控下能啟動下游報(bào)告基因在C E A 陽性的肺癌細(xì)胞A 5 4 9 ，S P C —A 一1 中表達(dá)。經(jīng)G 4 1 8 抗性克隆篩選后，R T - P C R證實(shí)T K ／C D 基因?qū)肽康募?xì)胞中。5 一F C 和G C V 對A 5 4 9 ／T K + C D ，S P C —A —l ／T K + C D細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用，半數(shù)抑制