核基質(zhì)附著區(qū)MAR增強Survivin啟動子驅(qū)動的雙自殺基因CD-TK靶向治療胃癌的實驗研究.pdf

1、世界衛(wèi)生組織(WHO)國際癌癥研究機構(gòu)(TheInternationalAgencyforResearchonCancer)發(fā)表的《2014年全球癌癥報告》稱:2012年全球癌癥患者和死亡病例都在令人不安地增加，中國新增癌癥病例高居世界第一位。在肝、食道、胃和肺等4種惡性腫瘤中，中國新增病例和死亡人數(shù)均居世界首位。胃癌(gastriccancer)是發(fā)生在消化系統(tǒng)胃黏膜上皮組織的惡性腫瘤。它是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病

2、率為25.2/10萬，占全部惡性腫瘤死亡的23.2％，居各類腫瘤的首位。早期胃癌多無癥狀或缺乏典型的臨床表現(xiàn)，普查的依從性差，費用較高，大部分病人發(fā)現(xiàn)時多已處于進展期。傳統(tǒng)的治療效果不理想，預后較差，術后5年生存率并不能讓人滿意，死亡率仍保持在較高水平。因此尋找一種有效的、新的胃癌治療方法以提高患者的生存率尤為重要。
　　近年來，分子生物學的發(fā)展十分迅速，DNA重組技術日益成熟，基因治療(genetherapy)在基礎研究方面已經(jīng)

3、取得了很大的進展，成為了一種新的治療手段。目前腫瘤基因治療包括許多策略，如基因沉默治療、自殺基因療法、反義基因療法、基因替換療法、免疫基因治療、抑癌基因治療、針對一些細胞因子的基因治療、針對耐藥基因的治療、腫瘤DNA疫苗、抗端粒酶療法等幾個方面。隨著基因治療策略的不斷發(fā)展和載體的開發(fā)應用，胃癌自殺基因治療(suicidegenetherapy)有望成為一種腫瘤治療新方法為人們所接受，更多的癌癥患者將從中獲益。本課題組前期研究結(jié)果表明，在

4、survivin基因啟動子的驅(qū)動下，GFP基因可在胃癌細胞SGC-7901中表達，但在正常胃上皮細胞中不表達。轉(zhuǎn)染的SGC-7901細胞中有胸苷激酶(thymidinekinase，TK)/胞嘧啶脫氨酶(cytosinedeaminase，CD)(CD/TK)融合基因的表達，但在轉(zhuǎn)染的正常胃上皮細胞中未見CD/TK融合基因的表達產(chǎn)物;轉(zhuǎn)染的胃癌SGC-7901細胞對前體藥物高度敏感，CD/TK雙自殺基因系統(tǒng)比任一單自殺基因有更好的殺傷靶

5、細胞的效果;體內(nèi)接種轉(zhuǎn)染SGC-7901細胞的裸鼠移植瘤實驗結(jié)果表明，與任一單自殺基因相比，雙自殺基因系統(tǒng)治療抑制腫瘤的生長的效果更強更顯著
　　盡管自殺基因治療目前已成功進行體內(nèi)外實驗研究，但是要達到理想的用于臨床治療胃癌的效果還有很大的差距，還有一些問題有待解決，比如外源基因的導入尚缺乏特異性和靶向性，載體特異性受體在腫瘤細胞中表達較低則會導致腫瘤細胞中病毒載體的表達較低等等。核基質(zhì)附著區(qū)(matrixattachmentre

6、gion，MAR)是指真核生物染色質(zhì)中能夠與核基質(zhì)(nuclearmatrix)或核骨架產(chǎn)生特異性結(jié)合的DNA序列，又稱為核骨架附著區(qū)(scaffoldattachmentregion，SAR)。MAR序列的功能主要是參與DNA復制調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種核生化過程，同時MAR可使染色質(zhì)形成獨立的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，從而避免位置效應引起的基因沉默。鑒于MAR序列和基因表達間的這種關系，特別是它能顯著地增強外源基因表達、克服位置效應、避免轉(zhuǎn)基因沉默，目

7、前作為一種順式調(diào)控元件已應用于轉(zhuǎn)基因生物工程中。
　　目前，通過應用MAR序列增強survivin啟動子介導的CD/TK雙自殺基因表達系統(tǒng)靶向治療胃癌的研究，迄今為止國內(nèi)外尚未見報道。因此，本研究中我們構(gòu)建并驗證了含有MAR序列的由survivin啟動子介導的CD/TK雙自殺基因表達系統(tǒng)是否可以增強對胃癌細胞及裸鼠的胃癌皮下移植瘤靶向殺傷作用，結(jié)果表明MAR序列元件可以顯著增強CD/TK雙自殺融合基因的表達，表達產(chǎn)物可以選擇性的抑

8、制胃癌細胞的增殖和促進細胞凋亡，對裸鼠的胃癌皮下移植瘤具有顯著的靶向殺傷作用。研究結(jié)果為胃癌的基因治療提供重要的理論依據(jù)，為臨床應用奠定實驗基礎。
　　本實驗研究內(nèi)容共分為四部分:
　　第一部分含有MAR的重組pMS-CD/TK雙自殺基因表達載體的構(gòu)建
　　目的：
　　分別克隆Survivin啟動子、CD、TK和MAR基因，構(gòu)建含有MAR的由survivin啟動子驅(qū)動的CD/TK雙自殺基因真核重組表達載體pMS-

9、CD/TK。
　　方法：
　　1.CD基因全長序列克隆和分析:設計引物，以提取的細菌E.coli基因組DNA為模板，PCR擴增CD基因全長序列，回收純化PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接、轉(zhuǎn)化細菌、篩選獲得重組質(zhì)粒pMD19-CD，進行酶切鑒定和測序驗證。
　　2.TK基因全長序列克隆和分析:設計引物，以提取的細菌E.coli基因組DNA為模板，PCR擴增TK基因全長序列，回收純化PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接、轉(zhuǎn)

10、化細菌、篩選獲得重組質(zhì)粒pMD19-TK，進行酶切鑒定和測序驗證。
　　3.Survivin啟動子基因序列克隆和分析:設計引物，以提取的人Hela細胞基因組DNA為模板，PCR擴增Survivin啟動子基因全長序列，回收純化PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接、轉(zhuǎn)化細菌、篩選獲得重組質(zhì)粒pMD19-Sur，進行酶切鑒定和測序驗證。
　　4.MAR序列克隆和分析:以人β珠蛋白MAR序列為參考設計引物，以提取的人Hela細胞基因組

11、DNA為模板，PCR擴增MAR基因全長序列，回收純化PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接、轉(zhuǎn)化細菌、篩選獲得重組質(zhì)粒pMD19-MAR，進行酶切鑒定和測序驗證。
　　5.重組pMS-CD/TK真核表達載體的構(gòu)建:以質(zhì)粒載體pEGFP-C1為基礎，依次將Survivin啟動子基因亞克隆連接構(gòu)建中間載體pEGFP-Sur，再與CD和TK基因連接構(gòu)建中間載體pS-CD/TK，最后將MAR基因序列連接構(gòu)建含有MAR的重組真核表達載體pMS-

12、CD/TK，并進行酶切鑒定和測序驗證。
　　結(jié)果：
　　1.PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切及測序鑒定成功克隆Survivin啟動子基因(948bp)，MAR基因(787bp)，CD基因（約1302bp）和TK基因（約1175bp）。
　　2.經(jīng)不同體系雙酶切和測序鑒定成功構(gòu)建含有MAR的重組表達載體pMS-CD/TK和不含MAR的重組表達載體pS-CD/TK。
　　第二部分重組pMS-CD/TK表達載體轉(zhuǎn)染胃癌細胞及表達分析<

13、br>　　目的：
　　重組表達載體pMS-CD/TK和pS-CD/TK分別轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901并分析雙自殺基因CD/TK在轉(zhuǎn)染細胞的表達情況。
　　方法：
　　1.采用脂質(zhì)體法將構(gòu)建好的重組表達載體pMS-CD/TK和pS-CD/TK分別轉(zhuǎn)化人胃癌SGC-7901細胞（靶細胞）及人胃黏膜上皮細胞GES-1（對照細胞）并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株。
　　2.應用實時熒光定量PCR法(Quantitativereal-tim

14、ePCR，qPCR)檢測轉(zhuǎn)染細胞株中CD/TK基因表達量;Westernblot法檢測轉(zhuǎn)染細胞中CD/TK蛋白的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.通過脂質(zhì)體介導方法可有效轉(zhuǎn)染SGC-7901和GES-1細胞。RT-PCR結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)染SGC-7901細胞組相比，質(zhì)粒pS-CD/TK或pMS-CD/TK轉(zhuǎn)染組分別擴增出一條與預期CD/TK片段大小相符的特異性條帶，而在GES-1細胞各實驗組中均檢測到CD/TK基因的表達。

15、r>　　2.qPCR結(jié)果顯示，CD/TK基因在轉(zhuǎn)染pMS-CD/TK質(zhì)粒的SGC-7901細胞中的相對表達量是轉(zhuǎn)染pS-CD/TK質(zhì)粒的7.7倍。
　　3.Westernblot結(jié)果也表明，與未轉(zhuǎn)染的SGC-7901細胞組相比，在轉(zhuǎn)染pMS-CD/TK或pS-CD/TK質(zhì)粒的SGC-7901細胞中可檢測到一條單一特異的蛋白條帶。
　　第三部分MAR增強雙自殺基因CD/TK表達對胃癌細胞的體外作用實驗
　　目的：

16、　　觀察MAR序列增強pMS-CD/TK雙自殺基因表達系統(tǒng)對胃癌SGC-7901細胞的體外殺傷作用。
　　方法：
　　1.SGC-7901和GES-1轉(zhuǎn)染細胞中分別加入前體藥物5-FC+GCV，MTT法檢測前體藥物對轉(zhuǎn)染細胞毒性，計算細胞的存活率。
　　2.轉(zhuǎn)染pS-CD/TK或pMS-CD/TK質(zhì)粒的SGC-7901細胞和未轉(zhuǎn)染的細胞按所設梯度比例混合，加入5-FC和GCV聯(lián)合用藥治療，MTT檢測細胞的存活率以觀察有

17、無旁觀者效應。
　　3.流式細胞技術進行轉(zhuǎn)染細胞凋亡率的檢測。
　　結(jié)果：
　　1.MTT檢測結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染細胞相比，5-FC和GCV聯(lián)合應用可以顯著降低轉(zhuǎn)染pS-CD/TK或pMS-CD/TK質(zhì)粒的SGC-7901細胞的存活率，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與轉(zhuǎn)染pS-CD/TK質(zhì)粒組相比，聯(lián)合應用前體5-FC+GCV后轉(zhuǎn)染pMS-CD/TK質(zhì)粒組SGC-7901細胞的存活率降低顯著，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜

18、0.01);與未轉(zhuǎn)染細胞組相比，5-FC和GCV對轉(zhuǎn)染的GES-1細胞存活率均無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2.隨著不斷增加轉(zhuǎn)染細胞的比例，細胞的存活率呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，而且存在明顯的旁觀者效應。
　　3.在給予5-FC+GCV前藥處理后，pS-CD/TK和pMS-CD/TK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率分別為17.65±1.58％、26.25±2.63％，明顯高于未轉(zhuǎn)染組對照細胞凋亡率(5.01±0.22％)(

19、P＜0.05)，且pMS-CD/TK轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率顯著高于pS-CD/TK組。
　　第四部分MAR增強雙自殺基因CD/TK表達對體內(nèi)裸鼠移植瘤的作用研究
　　目的：
　　觀察含有MAR的雙自殺基因CD/TK表達系統(tǒng)對裸鼠胃癌SGC-7901細胞移植瘤的抑制作用。
　　方法：
　　1.胃癌細胞裸鼠移植瘤動物模型的建立:Balb/c裸鼠右前肢腋窩皮下接種5×106SGC-7901細胞，第四天原位補種一次，建立

20、胃癌移植瘤動物模型。
　　2.雙自殺基因系統(tǒng)對裸鼠胃癌移植瘤模型的療效觀察:等到裸鼠移植瘤生長至直徑約為0.5cm時，將小鼠隨機分成3組，6只/每組:A組，空白對照組，僅用PBS處理;B組，注射重組pS-CD/TK質(zhì)粒聯(lián)合前藥5-FC+GCV治療組;C組，注射重組pMS-CD/TK質(zhì)粒聯(lián)合前藥5-FC+GCV治療組。在給藥治療后每三天測量各組小鼠的腫瘤大小，計算瘤體體積，治療結(jié)束時用頸椎脫臼法處死動物，取瘤測瘤重，計算抑瘤率，取腫

21、瘤組織切片行HE染色，鏡檢觀察腫瘤組織的病理變化。
　　3.qPCR法檢測裸鼠腫瘤組織中CD/TK雙自殺基因的表達
　　結(jié)果：
　　1.成功建立胃癌細胞裸鼠移植瘤動物模型，當裸鼠成瘤直徑達0.5cm后開始進行治療。各實驗組最終瘤重和抑瘤率結(jié)果為:A組:557.1±8.9mg;B組:251.7±14.2mg，63.1％;C組:118.8±10.2mg，82.6％。與對照組相比，治療組腫瘤體積、最終瘤重和抑瘤率明顯減小，差

22、異有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)。
　　2.腫瘤組織病理學觀察結(jié)果顯示，與對照組相比，治療組可見腫瘤細胞變性壞死及多發(fā)灶性出血散在分布，細胞分裂相少，伴有纖維組織增生，并可見較多的凋亡小體。
　　3.qPCR實驗結(jié)果表明，在注射轉(zhuǎn)染pS-CD/TK或pMS-CD/TK質(zhì)粒的移植瘤中檢測到CD/TK基因的表達，且后者的表達量是前者的約2.3倍;而PBS處理對照組未檢測到CD/TK基因的表達。
　　結(jié)論：
　　1.成

23、功構(gòu)建含有MAR的由survivin啟動子驅(qū)動的CD/TK雙自殺基因表達載體系統(tǒng)pMS-CD/TK。
　　2.重組CD/TK融合基因在胃癌細胞SGC-7901中成功表達，MAR基因在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平均可明顯增加CD/TK的表達量。
　　3.雙自殺CD/TK融合基因系統(tǒng)對胃癌SGC-7901細胞具有顯著的殺傷作用且有明顯的旁觀者效應。
　　4.MAR序列可通過增強CD/TK基因的表達對胃癌SGC-7901轉(zhuǎn)染細胞產(chǎn)生明顯殺