Survivin啟動(dòng)子調(diào)控SEA-PNP融合基因抗肺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 本研究首先以腫瘤特異性啟動(dòng)子替換pEGFP-C1載體中的CMV啟動(dòng)子，構(gòu)建攜帶Survivin啟動(dòng)子的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1/Surp，分別轉(zhuǎn)染肺癌A549及人胚成纖維細(xì)胞MRC-5比較其腫瘤特異性；以基因SOEing法擴(kuò)增sea-pnp融合基因，構(gòu)建pSGFP-SEA-PNP真核表達(dá)質(zhì)粒；通過RT-PCR鑒定重組質(zhì)粒在A549細(xì)胞中的特異性表達(dá)；通過PBMC刺激實(shí)驗(yàn)以MTT法檢測表達(dá)產(chǎn)物的超抗原活性；以MTT法檢

2、測重組質(zhì)粒在A549細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物將低毒的氟阿糖腺苷.磷酸（F-ara-AMP，fludarabine，氟達(dá)拉濱）轉(zhuǎn)化為高毒性2-氟腺嘌呤（2-F-adeninie，2-F-A）的細(xì)胞毒作用。本研究旨在為探索肺癌及其它腫瘤的靶向基因治療途徑及機(jī)理奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.用PCR法和基因克隆技術(shù)在真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1基礎(chǔ)上構(gòu)建Survivin啟動(dòng)子調(diào)控的、以綠色熒光蛋白為目的基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pSGFP（pEGF

3、P-C1/Surp）。 2.將該重組質(zhì)粒和pEGFP-C1分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人肺腺癌細(xì)胞（A549）和人胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5），72h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，并用Imagepro-Plus6.0分析Survivin啟動(dòng)子在肺癌細(xì)胞內(nèi)特異啟動(dòng)綠色熒光蛋白的表達(dá)水平。 3.以ATCC25923金黃色葡萄球菌基因組為模板，PCR擴(kuò)增sea基因，以JM109大腸桿菌基因組為模板，PCR擴(kuò)增PNP基因，然后以S

4、OEing法構(gòu)建sea-pnp融合基因。以pSGFP為基礎(chǔ)，構(gòu)建pSGFP-SEA-PNP真核表達(dá)質(zhì)粒；用脂質(zhì)體將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，72h后提取總RNA，通過RT-PCR鑒定重組質(zhì)粒在A549細(xì)胞中的特異性表達(dá)。 4.用脂質(zhì)體將pSGFP-SEA-PNP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，72h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清液和轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液。制備健康獻(xiàn)血者PBMC，用上清液和細(xì)胞裂解液進(jìn)行PBMC刺激實(shí)驗(yàn)，用MTT法、通過比較刺激指數(shù)以檢測其

5、促細(xì)胞增殖效應(yīng)。 5.用脂質(zhì)體將pSGFP-SEA-PNP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，36h后，更換有效濃度的氟阿糖腺苷-磷酸（F-ara-AMP，fludarabine，氟達(dá)拉濱）培養(yǎng)液，MTT法檢測其殺瘤效應(yīng)。 結(jié)果： 1.經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切及DNA測序證實(shí)pSGFP（pEGFP-C1/Surp）真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功；將重組質(zhì)粒及pEGFP-C1分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞72h后，在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的A549

6、細(xì)胞中觀察到了綠色熒光蛋白的表達(dá)，而在MRC-5細(xì)胞中無綠色熒光蛋白表達(dá)；在轉(zhuǎn)染pEGFP-C1的兩種細(xì)胞中均觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)。經(jīng)Imagepro-Plus6.0分析，在A549細(xì)胞中Survivin啟動(dòng)子啟動(dòng)活性約為CMV啟動(dòng)子活性的65.15％。 2.經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切及DNA測序證實(shí)pSGFP-SEA-PNP真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，RT-PCR結(jié)果表明，pSGFP-SEA-PNP質(zhì)粒在A549

7、細(xì)胞中成功表達(dá)了sea-pnp目的基因。 3.經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，pSGFP-SEA-PNP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞的裂解液具有促進(jìn)人PBMC增殖活性、上清液無明顯促PBMC增殖作用；裂解液實(shí)驗(yàn)組、上清液實(shí)驗(yàn)組和PHA陽性對(duì)照組的刺激指數(shù)分別為1.290、0.855和1.637。 4.經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，經(jīng)pSGFP-SEA-PNP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后所表達(dá)的產(chǎn)物能將F-ara-AMP轉(zhuǎn)化形成高毒性2-F-A，對(duì)A54

8、9細(xì)胞有一定殺傷作用。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了腫瘤特異性啟動(dòng)子Survivin調(diào)控的、以綠色熒光蛋白為目的基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，該啟動(dòng)子表現(xiàn)出腫瘤特異性，且在肺癌A549細(xì)胞中具有較好的啟動(dòng)效應(yīng)。 2.成功構(gòu)建Survivin啟動(dòng)子調(diào)控的、以sea-pnp融合基因?yàn)槟康幕虻恼婧吮磉_(dá)質(zhì)粒pSGFP-SEA-PNP，并在A549細(xì)胞中啟動(dòng)了sea-pnp基因的表達(dá)。 3.pSGFP-SEA-PNP質(zhì)粒在A54