舌癌耐藥相關(guān)基因TCRP1啟動子克隆及轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究.pdf

1、背景與目的:舌癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤,臨床常規(guī)采用手術(shù)為主并輔以放、化療的綜合治療方法。由于化療易產(chǎn)生耐藥性且其機制尚未闡明,影響了舌癌的治療效果。TCRP1基因是我室采用EST介導(dǎo)的定位候選克隆策略從舌癌多藥耐藥細胞(Tca8113/pym)中克隆的一個舌癌耐藥相關(guān)基因,體內(nèi)外研究已初步證實TCRP1基因能特異性介導(dǎo)舌癌細胞對順鉑的耐受。但TCRP1基因啟動子序列及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制尚不明確。本課題將在克隆TCRP1基因啟動子、預(yù)測

2、轉(zhuǎn)錄因子的基礎(chǔ)上圍繞基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律開展相關(guān)研究,為闡述TCRP1基因在舌癌耐藥中的作用機制提供新的理論依據(jù)。
　　 方法:(1)生物信息學(xué)分析TCRPl基因5’端調(diào)控區(qū),預(yù)測TCRP1基因候選啟動子區(qū)及轉(zhuǎn)錄起始位點,構(gòu)建系列缺失片段熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染舌癌細胞,檢測熒光素酶活性,確定TCRP1基因啟動子區(qū)域;(2)生物信息學(xué)分析能與TCRP1基因啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子及其位點,對預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子c-Myc采用染色質(zhì)免疫沉

3、淀實驗(CHIP)驗證:(3)將c-Myc與TCRP1啟動子報告載體pGL4+322/+709共轉(zhuǎn)染至Tca8113細胞中,或在Tca8113/PYM細胞中轉(zhuǎn)入pGL4+322/+709,再針對c-Myc進行抑制劑處理或RNA干擾后,通過熒光素酶活性分析檢測c-Myc對TCRP1啟動子活性的影響;(4)Western Blot檢測Tca8113與Tca8113/PYM細胞中c-Myc的表達差異;將c-Myc轉(zhuǎn)入Tca8113細胞,或在T

4、ca8113/PYM細胞對c-Myc進行抑制劑處理或RNA干擾后,采用RT-PCR、Western Blot檢測細胞中TCRP1表達的變化,MTS實驗檢測細胞對順鉑耐藥性的改變。
　　 結(jié)果:(1)生物信息學(xué)預(yù)測TCRP1基因啟動子位于-939bp至+700bp區(qū)域,且存在多個轉(zhuǎn)錄起始位點。熒光素酶報告基因?qū)嶒灤_定TCRP1基因5'端+322/+709區(qū)間為其啟動子所在區(qū)域,且在Tca8113/PYM細胞中的啟動活性高于Tca8

5、113細胞;(2)生物信息學(xué)分析TCRP1基因啟動子區(qū)為一不含TATA盒與CAAT盒的GC富集區(qū),并含有AP2,ADR1,Sp1,NF-1,RAF和c-Myc等多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,CHIP實驗表明轉(zhuǎn)錄因子c-Myc能與TCRP1基因啟動子區(qū)結(jié)合;(3)熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實c-Myc可上調(diào)TCRP1基因啟動子活性;(4)c-Myc在Tca8113/PYM細胞中的表達比Tca8113細胞高;c-Myc外源性高表達細胞(Tca8113/

6、c-Myc)中TCRP1 mRNA與蛋白表達增加,細胞對順鉑耐受增強;c-Myc表達沉默細胞(Tca8113/PYM-I)中TCRP1 mRNA與蛋白表達降低,細胞對順鉑耐受降低。
　　 結(jié)論:(1)TCRP1基因的啟動子位于其5'端+322/+709區(qū)域;(2)TCRP1基因啟動子是一個不含TATA盒與CAAT盒的GC富集區(qū),并含有AP2,ADR1,Sp1,NF-1,RAF和c-Myc等多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點;(3)轉(zhuǎn)錄因子c-