花生Oleosin啟動(dòng)子和Ara h1啟動(dòng)子功能鑒定及轉(zhuǎn)錄因子WRI1基因的in silico分析.pdf

1、花生是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的油料與經(jīng)濟(jì)作物，是全球四大油料作物之一，也是我國(guó)單產(chǎn)、總產(chǎn)和出口創(chuàng)匯額最高的油料作物。近年來(lái)隨著對(duì)油料作物油脂代謝相關(guān)基因的分離、組織特異性啟動(dòng)子等分子生物學(xué)的深入研究，使利用基因工程改良花生品質(zhì)成為花生分子育種研究的重要領(lǐng)域。為了鑒定花生Oleosin啟動(dòng)子和Arah1啟動(dòng)子功能，本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法分別用含有CaMV35S啟動(dòng)子的PBI121質(zhì)粒、含有花生Oleosin啟動(dòng)子的pB-OL1584

2、質(zhì)粒和含有花生Arah1啟動(dòng)子的pB-AH1716質(zhì)粒轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)卡那霉素抗性篩選及PCR鑒定獲得轉(zhuǎn)基因植株，用GUS組織化學(xué)染色法檢測(cè)啟動(dòng)子表達(dá)的組織特異性，用熒光光度分析法測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株的GUS酶活性，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GUS基因轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量；并利用電子克隆技術(shù)獲得了花生WRI1基因。研究的主要結(jié)果如下：
　　 1.轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得
　　 pB-OL1584質(zhì)粒轉(zhuǎn)化擬南芥的轉(zhuǎn)化率為0.28％，獲得含

3、Oleosin啟動(dòng)子的T5代株系2個(gè)；pB-AH1716質(zhì)粒轉(zhuǎn)化擬南芥的轉(zhuǎn)化率為0.3％，獲得含Arah1啟動(dòng)子的T2代株系2個(gè)；PBI121質(zhì)粒轉(zhuǎn)化擬南芥的轉(zhuǎn)化率為0.7％，獲得含CaMV35S啟動(dòng)子的擬南芥T4代株系5個(gè)。
　　 2.花生Oleosin啟動(dòng)子的表達(dá)特性分析
　　 比較含花生Oleosin啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因擬南芥中不同組織的GUS酶活力，結(jié)果表明：同一植株的不同組織之間GUS酶活力差異顯著，根中酶活力最強(qiáng)，

4、其次是莢果，莖和葉最弱；不同單株間酶活力差異顯著。單株O2-18的GUS酶活力最高，其根中GUS酶活力為4.01nmol/mg(protein)/min，莢果中為2.60nmol/mg(protein)/min，莖中為1.46nmol/mg(protein)/min，葉中為0.73nmol/mg(protein)/min。檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥中GUS基因轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)同一植株根中GUS基因相對(duì)表達(dá)量最高，其次莢果，在莖和葉中很少，

5、幾乎沒有；不同單株的GUS基因相對(duì)表達(dá)量存在差異，與酶活力的檢測(cè)結(jié)果一致。證明花生Oleosin啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)GUS基因在擬南芥基因組中表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度從強(qiáng)到弱依次為：根、莢果、莖和葉。
　　 3.花生Arah1啟動(dòng)子的表達(dá)特性分析
　　 比較含花生Arah1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因擬南芥中不同組織的GUS酶活力，結(jié)果表明：不同組織之間GUS酶活力差異顯著。根中酶活力最強(qiáng)，為1.748nmol/mg(protein)/min；其次是莢

6、果，為0.946nmol/mg(protein)/min；葉中GUS酶活力為0.705nmol/mg(protein)/min，莖中最弱為0.592nmol/mg(protein)/min。檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥中GUS基因轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)根中GUS基因相對(duì)表達(dá)量最高，其次莢果，莖和葉中較少，與酶活力的檢測(cè)結(jié)果一致。證明花生Arah1啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)GUS基因在擬南芥基因組中表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度從強(qiáng)到弱依次為：根、莢果、葉和莖。
　　

7、4.三種啟動(dòng)子表達(dá)特性比較
　　 比較含不同啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株I1-89(CaMV35S啟動(dòng)子)、O2-18(Oleosin啟動(dòng)子)和A2(Arah1啟動(dòng)子)的GUS酶活力，結(jié)果表明：O2-18和A2根中酶活力分別為I1-89的0.66倍和0.29倍；莖中酶活力分別是I1-89的1.14倍和0.46倍；葉中的酶活力分別是I1-89的1.04倍和1.00倍；莢果中的酶活力分別是I1-89的2.03倍和0.74倍；證明在擬南芥

8、莢果中花生Oleosin啟動(dòng)子表達(dá)高于CaMV35S啟動(dòng)子，在莖和葉中表達(dá)差異不明顯，在根中表達(dá)低于CaMV35S啟動(dòng)子；花生Arah1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因在擬南芥中表達(dá)均低于CaMV35S啟動(dòng)子和花生Oleosin啟動(dòng)子。
　　 5.花生轉(zhuǎn)錄因子WRI1基因的克隆及序列分析
　　 電子克隆獲得了花生WRI1的cDNA序列(AhWRI1)，AhWRI1序列長(zhǎng)1169bp。用生物信息學(xué)方法進(jìn)行序列分析，AhWRI1含一個(gè)長(zhǎng)

9、度為780bp的完整開放閱讀框架，編碼259個(gè)氨基酸。編碼蛋白AhWRI1包含2個(gè)典型的AP2功能域，是親水性蛋白，在蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)上與擬南芥和油菜的WRI1相似。AhWRI1與擬南芥、油菜WRI1氨基酸保守序列同源性在81.87％-100％之間。AhWRI1無(wú)序化程度為71.8％，比擬南芥低3.8％，比油菜高2.5％。亞細(xì)胞定位顯示AhWRI1在細(xì)胞核內(nèi)，并預(yù)測(cè)該蛋白具有轉(zhuǎn)錄復(fù)制，調(diào)控及轉(zhuǎn)錄結(jié)合的可能性分別為0.244，0.226，