黑腹果蠅基因間區(qū)microRNA基因的轉錄和啟動子分析.pdf

1、MicroRNA（miRNA）是一類分布廣泛，大小約為22個核苷酸的內源性非編碼RNA，參與蛋白質編碼基因的轉錄后調控。目前，對miRNA基因轉錄的了解仍十分有限，一般認為內含子區(qū)域的miRNA及其與宿主基因共轉錄，而基因間區(qū)的miRNA則獨立轉錄，擁有自己的啟動子。本論文主要研究黑腹果蠅Drosophila melanogaster基因間區(qū)miRNA的轉錄，解析miRNA的基因結構，檢測miRNA的基因啟動子活性，搜尋啟動子區(qū)moti

2、f并進行啟動子預測軟件的評估。本項研究對更好地理解復雜的miRNA基因的轉錄水平調控，具有重要的意義。
　　 一、果蠅基因間區(qū)pri-miRNA基因的擴增及全長克隆
　　 采取“開源節(jié)流”策略，應用RNAi技術干擾pri-miRNA加工成熟的關鍵核酸酶Drosha，輔以CuSO4刺激，達到了提高pri-miRNA轉錄本豐度的目的。進一步利用RACE技術克隆果蠅基因間區(qū)pri-miRNA轉錄本，獲得bantam、mir-2

3、76a、mir-277和mir-8的5'末端，其中mir-276a和mk-277均含有兩個TSS，而mir-8的2個不同的5’RACE克隆具有選擇性剪接，指向同一個5’末端；同時克隆到bantam、mir-2b-1、mir-10、mir-276a和mir-277的3’末端，且mir-10具有兩個poly（A）尾巴。通過以上工作，拼接出pri-bantam、pri-mir-276a、pri-mir-277的全長轉錄本。
　　 二、

4、果蠅pri-miRNA的基因結構
　　 經(jīng)過end-to-end PCR驗證.結果表明pri-bantam全長2054nt.轉錄起始位點（TSS）“G”距離pre-bantam的5’末端992nt，而且意外的是pri-bantam含有5個內含子，pre-bantam位于第一個長內含子中，第四個內含子也保留子pri-bantam轉錄本。另外，pri-mir-276a和pri-mir-277轉錄本全長分別1632nt和1300nt，

5、并且均含有多個5’末端?？寺〉乃?’端都包含一串連續(xù)“A”，并有多聚腺苷酸加尾信號（polyA signal，AATAAA）。此外，mir-8的5’端含有一個選擇性剪切的內含子，mir-10具有多個polyA尾巴。以上特征都是典型的RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ）轉錄基因的特征，這暗示pri-miRNA轉錄本是由polⅡ轉錄而來。
　　 三、果蠅miRNA基因核心啟動子的錨定及活性分析
　　 初步分析表

6、明，pri-bantam上游27bp處有一個標準的TATA盒子，而mir-276a、mir-277和mir-8不具有這個結構。Pri-mir-276a和pri-mir-277的兩個TSS，意味著可能有兩個核心啟動子區(qū)。利用非磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ的抗體（anti-PolⅡa，8WG16）進行體內的染色質免疫共沉淀分析（Chromatin Immunoprecipitation assay，ChIP）。ChIP實驗證實了這些miRNA的核

7、心啟動子區(qū)可以被RNA聚合酶Ⅱ（polⅡ）結合。進一步，將miRNA基因（mir-276a，bantam）的核心啟動子克隆到熒光素酶報告基因載體上游，并轉染至果蠅S2細胞中，結果表明啟動子能成功驅動熒光素酶基因的表達，顯示出polⅡ啟動子活性，表明大部分miRNA是由polⅡ負責轉錄的。
　　 四、果蠅miRNA基因啟動子區(qū)的轉錄因子結合預測及轉錄因子Myc免疫共沉淀分析
　　 實驗的方法找到了果蠅miRNA基因的啟動子

8、，進一步利用生物信息學方法預測了區(qū)域中的轉錄因子結合位點（Transcription Factors Binding Sites）。一些與果蠅發(fā)育調控相關的重要轉錄因子也可能參與到調控miRNA基因的表達，如Kruppel，Hunchback，Giant和Zeste被預測在bantam的核心啟動子區(qū)。同時miRNA可能會被一些共同的轉錄因子調控。另外，針對癌基因c-Myc轉錄因子，用抗c-Myc抗體進行染色質免疫共沉淀（ChIP）實驗，

9、結果顯示c-Myc可以結合到bantam、mir-277和mir-8的啟動子區(qū)，但是不能結合到mir-276a的啟動子區(qū)，表明c-Myc的確可能參與調控眾多miRNA基因的表達。
　　 五、pri-miRNA基因的motif與啟動子預測軟件評估
　　 尋找miRNA基因的順式調控元件（cis-regulating elements），有助于鑒別miRNA基因的特征。運用生物信息軟件分析了miRNA基因上游的motif，并

10、將找到的這些motif和已知的TRANSFAC及JASPAR數(shù)據(jù)庫做了比較，表明miRNA基因啟動子區(qū)motif可能具有調控miRNA基因表達的重要功能。目前啟動子/TSS預測軟件大都是針對蛋白質編碼基因的，尚未有針對miRNA基因的軟件或算法。綜合已報道證實的線蟲、大鼠、小鼠、人等其他物種pri-miRNA基因序列，對目前使用比較廣泛的啟動子預測軟件McPromoter，TSSG，TSSW，Promoter2.0，PromoterSc