人qki基因啟動(dòng)子克隆及TNF對(duì)qki基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的初步研究.pdf

1、QKI是屬于STAR（signal transduction and activation of RNA）家族的一種RNA結(jié)合蛋白，在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中參與髓鞘發(fā)育，及胚胎發(fā)育中的心血管系統(tǒng)發(fā)育。Qki基因不同部位的突變體小鼠可以表現(xiàn)在出生前死于心血管肌肉系統(tǒng)發(fā)育障礙，或于出生后10 天表現(xiàn)為快速的震顫以及到了成年強(qiáng)直性驚厥的發(fā)作 。 Qki 基因長(zhǎng)度大約為65kb ,含有9 個(gè)外顯子,通過(guò)不同的剪接可以

2、產(chǎn)生至少5 個(gè)轉(zhuǎn)錄子Kondo(1999) 發(fā)現(xiàn)含量較高的是5kb (qkI-5) 、6kb (qkI-6)和7kb ( qkI-7) , 分別編碼產(chǎn)生QKI-5 、QKI-6 和QKI-7 三種蛋白質(zhì)。它們擁有共同的KH 結(jié)構(gòu)域及其兩側(cè)的QUA1 和QUA2 結(jié)構(gòu)域,但羧基端和3’非翻譯區(qū)各不相同。其中QKI-5 主要定位于胞核中，QKI-6，QKI-7 主要定位于胞漿中。 Pilotte 等發(fā)現(xiàn)QKI-7 可以引起成纖維細(xì)

3、胞和原代培養(yǎng)的大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡,它的致凋亡序列是位于羧基末端的14 個(gè)氨基酸殘基,QKI-5 和QKI-6 不但不能誘導(dǎo)凋亡,反而可以與QKI-7 形成二聚體,并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi),抑制QKI-7 的致凋亡作用[7] 。另外許多有關(guān)QKI的功能研究大都集中在神經(jīng)系統(tǒng)，特別是與髓鞘發(fā)育相關(guān)的分子機(jī)理方面。 NFKappaB 作為一種氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子在胚胎的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，并且可以調(diào)節(jié)許多與炎癥有關(guān)的基因的表

4、達(dá)。 NFKappaB 的激活可以通過(guò)促進(jìn)一些基因的表達(dá)來(lái)啟動(dòng)炎癥的發(fā)生，這些基因包括細(xì)胞因子，白細(xì)胞黏附分子以及化學(xué)趨化因子等基因。 因此NFKappaB 在一些與炎癥有關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有著重要的作用，其中包括動(dòng)脈粥樣硬化，炎癥性腸病，自身免疫性關(guān)節(jié)炎，腎小球腎炎，敗血性休克，腫瘤的發(fā)生等等。另一方面，qki 基因特定部位的突變會(huì)導(dǎo)致胚胎心血管系統(tǒng)嚴(yán)重的發(fā)育障礙。其次，對(duì)qki 基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行分析，具有NF

5、KappaB 的結(jié)合位點(diǎn)。最后，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，QKI 作為一種RNA 結(jié)合蛋白，有一些與炎癥有關(guān)的靶分子，如VCAM ，COX-2 等等。但有關(guān)QKI 參與心血管發(fā)育及炎癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的分子機(jī)理，具體的還完全不清楚。 為了進(jìn)一步研究在心血管發(fā)育及炎癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，qki在外界不同信號(hào)刺激下表達(dá)水平的變化，首先我們構(gòu)建了qki基因啟動(dòng)子的熒光報(bào)告系統(tǒng)，并構(gòu)建了不同的啟動(dòng)子截短體，從啟動(dòng)子水平證實(shí)了炎癥刺激因子TNF對(duì)q

6、ki的調(diào)控作用，其次通過(guò)RT-PCR初步探索了qki在TNF刺激下的轉(zhuǎn)錄水平的變化。最后表達(dá)并純化了6×His -QKI-7 融合蛋白，制備了高特異性的多克隆抗體 。由于QKI不同的剪接體之間有90％以上的氨基酸同源序列，有幾乎相同的抗原表位，因此利用6×His-QKI-7 融合蛋白所制備的多克隆抗體可以識(shí)別QKI不同的剪接體，其實(shí)是針對(duì)各種QKI蛋白的多克隆抗體 。我們利用所制備的QKI蛋白的多克隆抗體同樣檢測(cè)了TNF刺激下的qki基

7、因表達(dá)水平的變化。此外，我們還比較了利用三種不同的免疫佐劑制備QKI多克隆抗體的效果 。 主要研究結(jié)果包括： 1．首先我們克隆了qki 基因翻譯起始位點(diǎn)ATG 上游序列并構(gòu)建熒光報(bào)告系統(tǒng)，通過(guò)檢測(cè)熒光素酶的活性證明該報(bào)告系統(tǒng)有啟動(dòng)子活性。 通過(guò)NCBI 基因組數(shù)據(jù)庫(kù)查找到基因ATG 上游約2165bp 序列，利用PCR 技術(shù)擴(kuò)增該片斷，將其克隆到pGL3-BasicVector 中，插入到熒光素酶報(bào)告基因上

8、游多克隆結(jié)合位點(diǎn)處，這樣當(dāng)檢測(cè)到熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)，就說(shuō)明克隆的片斷存在啟動(dòng)子序列或轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。 我們將構(gòu)建的啟動(dòng)子區(qū)熒光報(bào)告系統(tǒng)(QP-luc，pBind）轉(zhuǎn)入Hy906和293 細(xì)胞中，顯示熒光素酶的表達(dá)，說(shuō)明克隆的qki 基因ATG 上游序列含啟動(dòng)子活性。通過(guò)TNF 和其下游NFKappaB 的活性亞單位P65刺激可以使啟動(dòng)子活性降低，用IkappaB mutant form 可以阻斷TNF對(duì)QKI 基因啟動(dòng)子活性

9、的下調(diào)作用。 2．將克隆的啟動(dòng)子區(qū)依照所預(yù)測(cè)的NFKappaB 結(jié)合位點(diǎn)依次截短，構(gòu)建分別包含3，2，1 個(gè)NFKappaB 結(jié)合位點(diǎn)的qki 啟動(dòng)子截短體，通過(guò)TNF 及其相關(guān)信號(hào)途徑分子的刺激和阻斷進(jìn)行啟動(dòng)子活性的分析。 對(duì)克隆的約2kb 片段進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)四個(gè)可能的NFKappaB 結(jié)合位點(diǎn)。因此，構(gòu)建qki 基因啟動(dòng)子區(qū)3 個(gè)5’端缺失體熒光報(bào)告載體QP3（1652bp，預(yù)測(cè)含有3 個(gè)NFKappaB

10、 結(jié)合位點(diǎn)）、QP2（1083 bp，預(yù)測(cè)含有2 個(gè)NFKappaB 結(jié)合位點(diǎn)）、QP1（968 bp，預(yù)測(cè)含有1 個(gè)NFKappaB 結(jié)合位點(diǎn)）。將構(gòu)建的各啟動(dòng)子熒光報(bào)告系統(tǒng)轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞中，結(jié)果顯示三個(gè)截短體熒光素酶表達(dá)在TNF 和其下游NFKappaB 的活性亞單位P65 刺激下均有降低，QP4 和QP1 用IkappaB mutant form 可以阻斷TNF 對(duì)qki 基因啟動(dòng)子活性的下調(diào)作用。 提示克隆的最短序列QP

11、1（968 bp，計(jì)算機(jī)分析證實(shí)該序列中含有一個(gè)NFKappaB 結(jié)合位點(diǎn)）可能是含有活性NFKappaB 結(jié)合位點(diǎn)qki 基因啟動(dòng)子的最短區(qū)域。 3．通過(guò)RT-PCR 檢測(cè)TNF 作用下不同時(shí)間點(diǎn)qki 基因的轉(zhuǎn)錄水平的變化，結(jié)果提示TNF 作用24 小時(shí)內(nèi)qki 基因的轉(zhuǎn)錄水平呈先降低后升高的趨勢(shì)。 4．通過(guò)western-blot 檢測(cè)TNF 作用下不同時(shí)間點(diǎn)qki 基因的表達(dá)水平的變化，結(jié)果提示TNF 作用1

12、6 小時(shí)內(nèi)qki 基因的表達(dá)水平呈逐漸降低的趨勢(shì)。 5．QKI 的原核表達(dá)純化和多克隆抗體的制備。將已成功插入QKI-7編碼區(qū)cDNA 并測(cè)序正確的PET32b(+)原核表達(dá)載體用熱休克法轉(zhuǎn)化BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞細(xì)菌，以IPTG 誘導(dǎo)6×His-QKI-7 融合蛋白的表達(dá)，分別經(jīng)金屬鰲合柱，反向柱和強(qiáng)陰離子交換柱層析純化。經(jīng)SDS-PAGE 、Western blot 鑒定后，應(yīng)用純化的融合蛋白，分別以弗氏佐劑，聚丙

13、烯酰胺凝膠，NC 膜作為佐劑免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。由于QKI 不同的剪接體之間有90％以上的氨基酸同源序列，有幾乎相同的抗原表位，因此利用6×His -QKI-7 融合蛋白所制備的多克隆抗體可以識(shí)別QKI 不同的剪接體，其實(shí)是針對(duì)各種QKI 蛋白的多克隆抗體。Western blot 鑒定抗體的效價(jià)和特異性。綜上所述本研究通過(guò)構(gòu)建qki 啟動(dòng)子區(qū)熒光報(bào)告系統(tǒng)并通過(guò)熒光素酶檢測(cè)及RT-PCR，Western blot 初步確定T