家蠶孵化酶基因I、II啟動(dòng)子克隆分析及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的初步鑒定.pdf

1、本課題組業(yè)已報(bào)道了家蠶的兩種孵化酶基因（BmHEⅠ和BmHEⅡ）。在家蠶胚胎發(fā)育期，BmHEⅠ和BmHEⅡ基因轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)表達(dá)量均隨著胚胎發(fā)育而上升并在孵化時(shí)達(dá)到頂峰，兩者的瞬時(shí)表達(dá)性基本與孵化酶基因相吻合。然而，在家蠶幼蟲期，在家蠶中腸中檢測到BmHEⅠmRNA，提示其可能具有其他功能；在家蠶精巢組織中檢測到 BmHEⅡ基因轉(zhuǎn)錄本，推測其可能與家蠶的精子發(fā)生有關(guān)。本研究對(duì)兩個(gè)家蠶孵化酶基因的啟動(dòng)子進(jìn)行克隆分析并對(duì)其部分轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)

2、進(jìn)行初步鑒定。本研究主要獲得以下三部分結(jié)果：
　　1.BmHEⅠ和BmHEⅡ基因啟動(dòng)子的克隆與分析:PCR克隆獲得兩種家蠶孵化酶基因的上游啟動(dòng)子序列，BmHEⅠp，長度為1350bp，BmHEⅡp，長度為1240bp。利用在線軟件NNPP預(yù)測出BmHEⅠp，BmHEⅡp的核心啟動(dòng)子位置，BmHEⅠp上僅有一個(gè)核心啟動(dòng)子，BmHEⅡp上含有多個(gè)核心啟動(dòng)子；利用在線軟件Alibaba預(yù)測比較了BmHEⅠp與BmHEⅡp上可能存在的轉(zhuǎn)錄

3、因子結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果顯示BmHEⅠp上特有的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)有CREB、NF-1、c-Jun等13個(gè)，BmHEⅡp上特有的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)有HNF-4α1、Pit-1a、TEF、MEB-1等17個(gè)。
　　2.家蠶中腸、精巢和蠶卵胚胎核蛋白與BmHEⅠp和BmHEⅡp上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)探針進(jìn)行EMSA分析:首先采用細(xì)胞核蛋白質(zhì)提取試劑盒抽提家蠶中腸、精巢和蠶卵胚胎核蛋白，中腸核蛋白濃度為4.73μg/μL、精巢核蛋白濃度為1.17μ

4、g/μL，蠶卵胚胎核蛋白濃度平均為4.92μg/μL；依據(jù)前人的研究，從所預(yù)測的BmHEⅠp和BmHEⅡp上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)中，篩選出BmHEⅠp上的Oct-1、CRE-BP1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，BmHEⅡp上的HNF-4α1、TBP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，利用 IR700染料對(duì)上述四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)序列進(jìn)行標(biāo)記，將其作為探針與上述所抽提的核蛋白進(jìn)行凝膠遷移阻滯分析（EMSA）。中腸核蛋白能與Oct-1、CRE-BP1探針特異性結(jié)合，精巢核

5、蛋白能與HNF-4α1、TBP探針特異性結(jié)合，然而，精巢核蛋白不能與Oct-1、CRE-BP1探針結(jié)合，中腸核蛋白不能與HNF-4α1探針結(jié)合，推測在幼蟲發(fā)育期，家蠶孵化酶基因表達(dá)的組織特異性可能與Oct-1、CRE-BP1、和HNF-4α1相關(guān)；催青第7~9天的蠶卵核蛋白能與TBP探針結(jié)合，催青第1~9天的蠶卵核蛋白能與HNF-4α1探針結(jié)合，推測在胚胎發(fā)育期，家蠶孵化酶基因的表達(dá)調(diào)控可能與TBP、HNF-4α1相關(guān)。
　　3．

6、EMSA阻滯條帶的質(zhì)譜分析：利用毛細(xì)管高效液相色譜法對(duì)上述EMSA的阻滯條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果表明，未能直接證明凝膠阻滯條帶中存在Oct-1、CRE-BP1、HNF-4α1和 TBP轉(zhuǎn)錄因子成分，然而在凝膠阻滯條帶中包含了其他轉(zhuǎn)錄因子成分。Apoptosis-related protein1CAD、Cyclic AMP-regμLated protein和FancJ-like protein等能與 CRE-BP1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合；1

7、4-3-3 proteinzeta、actin-related2/3 complex subunit2和Beadex/dLMO protein等能與Oct-1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合；Fanconi anemia、complementation groupⅠ和 HSP90等能夠與 HNF-4α1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合；Interleukin enhancer binding factor isoform1、p53和translation in