內毒素休克小鼠RIG-I基因啟動子結合蛋白的篩選及鑒定.pdf

1、目的:維甲酸誘導基因Ⅰ(retinoic acid-induced gene，RIG-Ⅰ)具有抗病毒、殺滅微生物、抗腫瘤、介導免疫反應等生物學作用，并在機體多種組織和細胞中都有表達，不同刺激在不同細胞、不同種系可能通過不同的信號通路誘導RIG-Ⅰ基因的表達，相關的調控機制也不盡相同。目前對人源性RIG-Ⅰ基因相關的調控機制及其在內毒素休克模型中的表達機制則知之甚少。因此我們的實驗目的旨在了解內毒素休克中哪些蛋白參與了人RIG-Ⅰ基因的表

2、達調控。
　　方法:用RT-PCR方法檢測LPS對小鼠肝組織RIG-Ⅰ mRNA表達的影響;腹腔注射LPS法制備內毒素休克小鼠模型;用核質分離的方法提取正常小鼠和內毒素休克小鼠肝組織核蛋白;設計合適的引物，用PCR方法擴增人RIG-Ⅰ啟動子探針;然后從“組學”的角度和活體組織水平，根據(jù)DNA-蛋白質相互作用的原理，基于生物素-鏈親和素系統(tǒng)、磁珠分離技術，2-D DIGE分離差異蛋白等技術篩選正常小鼠和內毒素休克小鼠肝臟組織中能與人

3、RIG-Ⅰ啟動子發(fā)生相互作用的結合蛋白;并用質譜技術對篩選出來的部分蛋白進行質譜鑒定;最后利用生物學軟件對鑒定出來的蛋白進行簡單的功能查找及蛋白亞細胞定位分析。
　　結果:小鼠肝組織RIG-Ⅰ mRNA的表達與LPS刺激存在著時間依賴的關系，LPS（25mg/kg）腹腔注射小鼠后，小鼠肝組織中RIG-Ⅰ mRNA的表達先增多后減少;頸動脈插管，LPS(25mg/kg)腹腔注射小鼠后，150min時小鼠平均動脈血壓降低至40mmHg

4、，提示內毒素休克小鼠模型制備成功;用SDS-PAGE方法分離了正常小鼠和內毒素休克小鼠肝組織胞漿蛋白和胞核蛋白，胞漿蛋白和胞核蛋白帶型明顯不同，提示小鼠肝組織核蛋白提取成功;用DNA-Pull down分析、2-D DIGE技術、質譜技術綜合分析后得到15個可能參與人RIG-Ⅰ啟動子轉錄調控相關的蛋白分子，分別為:四聯(lián)重復肽蛋白29(Tetratricopeptide repeat protein29)、轉錄輔助因子HES-6（Tran

5、scription cofactor HES-6）、絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶7（Mitogen-activated protein kinase kinase kinase7）、鈣蛋白酶-6（Calpain-6）、鉀電壓門控通道亞科F成員1(Potassium voltage-gated channel subfamily F member1)、張力蛋白-3(Tensin-3)、Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子1(Rho guanine n

6、ucleotideexchange factor1)、組氨酰-tRNA合成酶（Histidyl-tRNA synthetase）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶TAO3(Serine/threonine-protein kinase TAO3)、富含亮氨酸重復和WD重復蛋白1(Leucine-rich repeat and WD repeat-containing protein1)、E3泛素蛋白連接酶HUWE1(E3 ubiquitin-pr

7、otein ligase HUWE1)、細胞分裂蛋白激酶18(Cell division protein kinase18)、40S核糖體蛋白SA(40S ribosomal proteinSA)、核不均一核糖核蛋白A3(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A3)、延伸因子1(Elongation factor1-delta);最后用生物學軟件對鑒定出來的蛋白進行了簡單的功能查找及亞細胞定位分