柑橘CsGABP啟動(dòng)子作用元件分析及互作蛋白篩選.pdf

1、有機(jī)酸是決定柑橘果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)的重要組分之一，其含量的高低與果實(shí)的衰老進(jìn)程和貯藏性能密切相關(guān)。高含量的有機(jī)酸有助于果實(shí)的保鮮，因此尋找維持高含量有機(jī)酸或減緩有機(jī)酸降解的方法來延緩柑橘果實(shí)衰老和維持果實(shí)品質(zhì)對(duì)柑橘采后研究具有重要意義。檸檬酸是柑橘果實(shí)中最主要的有機(jī)酸，其含量在采后呈波動(dòng)下降趨勢(shì)。GABA代謝支路與TCA循環(huán)緊密聯(lián)系，是調(diào)控檸檬酸含量的重要途徑，參與調(diào)控采后柑橘果實(shí)有機(jī)酸的降解。GABP（線粒體GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）是聯(lián)系GABA

2、支路與TCA循環(huán)的紐帶，可作為調(diào)控柑橘果實(shí)采后檸檬酸代謝的關(guān)鍵點(diǎn)。尋找GABP上游調(diào)控因子，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平探索GABP對(duì)柑橘果實(shí)采后檸檬酸代謝的調(diào)控機(jī)制，可為開發(fā)調(diào)控柑橘采后有機(jī)酸含量及延緩衰老的技術(shù)提供理論依據(jù)。本研究通過克隆柑橘GABP基因（CsGABP）并分析其啟動(dòng)子順式作用元件，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選及酵母單雜交技術(shù)驗(yàn)證調(diào)控CsGABP的候選轉(zhuǎn)錄因子，并探討其調(diào)控機(jī)制，研究結(jié)果如下:
　　1.克隆得到HB柚和無酸柚CsGABP

3、基因組全長(zhǎng)及啟動(dòng)子序列，并克隆HB柚、無酸柚、冰糖橙、錦橙、沙田柚五個(gè)柑橘品種CsGABP基因ORF區(qū)。發(fā)現(xiàn)HB柚和無酸柚各存在兩條CsGABP基因，分別為CsGABP-a，CsGABP-b和CsGABP-a，CsGABP-c，其中CsGABP-a是共有的一條，gDNA相似度高達(dá)99％，啟動(dòng)子序列相似度高達(dá)98％，而ORF區(qū)在各品種間相對(duì)保守且只有一條CsGABP-a，表明可能只有CsGABP-a發(fā)生轉(zhuǎn)錄。
　　2.分析CsGAB

4、P-a基因啟動(dòng)子順式作用元件，發(fā)現(xiàn)其包括光響應(yīng)元件G-box，GT1-motif，TCT-motif等，逆境相關(guān)的作用元件G-box，W-box，GCC-Box，TGACG-motif等，激素響應(yīng)有關(guān)元件，如G-box和ABRE(ABA)，GCC-box(ETH), TGACG-motif和 CGTCA-motif(MeJA), GARE-motif(GA),TCA-element(SA)，這些作用元件的存在表明CsGABP-a基因的表

5、達(dá)可能受光信號(hào)、逆境和激素誘導(dǎo)。
　　3.轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析并篩到與CsGABP基因共表達(dá)的23個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因，通過qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)CsGABP基因及挑選轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)趨勢(shì)進(jìn)行相關(guān)性分析，挑選到與CsGABP基因表達(dá)顯著相關(guān)的5類共9個(gè)候選轉(zhuǎn)錄因子基因:CsWRKY40, CsWRKY33, CsbHLH, CsERF72, CsZF-B, CsBZIP11, CsABR1,CsBZIP21, CsZF-A2。
　　4

6、.預(yù)測(cè)候選轉(zhuǎn)錄因子bHLH類，WRKY類，AP2/EREBP類，bZIP類可能綁定元件分別為G-box，W-box，GCC-box，TGACG-motif。設(shè)計(jì)并構(gòu)建CsGABP-a啟動(dòng)子中包含這些元件的8個(gè)元件及片段誘餌載體和9個(gè)候選轉(zhuǎn)錄因子獵物載體，酵母單雜篩選cDNA文庫(kù)及“點(diǎn)對(duì)點(diǎn)”驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)CsWRKY33、CsABR1分別與W-Box、GCC-Box作用元件互作，CsbHLH與QbHLH啟動(dòng)子片段互作，CsZF-B，CsbHLH