TGF-β1對UGBP啟動子活性的影響及核心啟動子區(qū)域的篩選.pdf

1、子宮珠蛋白(uteroglobin，UG)是一種小分子分泌性蛋白，它主要由襯覆于遠(yuǎn)端細(xì)支氣管的非纖毛上皮細(xì)胞——Clara細(xì)胞所分泌。UG具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抑制成纖維細(xì)胞趨化以及抑制腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)侵襲等多種生物活性。UG的生物學(xué)作用有賴于子宮珠蛋白結(jié)合蛋白(uteroglobin binding protein，UGBP)的介導(dǎo)。國內(nèi)外對UGBP的研究了解甚少，而有關(guān)UGBP基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建UGBP

2、基因5’側(cè)翼啟動子區(qū)(-2234bp～+64bp)報(bào)告基因質(zhì)粒，在此基礎(chǔ)上觀察TGF-β1對UGBP基因啟動子活性的影響，初步篩選出UGBP核心啟動子區(qū)，為進(jìn)一步對UGBP轉(zhuǎn)錄調(diào)控原理的研究提供新的線索。
　　 方法:①采用PCR法從小鼠的總DNA中擴(kuò)增出UGBP基因5’側(cè)翼啟動子區(qū)（-2234bp～+64bp），經(jīng)雙酶切后插入到空載體pGL3-basic中，構(gòu)建報(bào)告基因重組質(zhì)粒。②重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3T3和HBE細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48

3、 h后雙螢光素酶檢測UGBP啟動子活性;③采用smad3蛋白抑制劑(SIS3)預(yù)處理，雙螢光素酶檢測UGBP的啟動子活性。④構(gòu)建不同長度UGBP啟動子報(bào)告基因重組質(zhì)粒，雙螢光素酶檢測UGBP的啟動子活性。
　　 結(jié)果:
　　 1.測序結(jié)果顯示:插入到空載體pGL3-basic中的目的片段大小、方向正確，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-UGBP-FL、A、S、903、567、321。
　　 2.雙螢光素酶檢測啟動子活性結(jié)

4、果顯示:UGBP啟動子在HBE細(xì)胞中的活性高于NIH3T3細(xì)胞中的活性(p＜0.05)。
　　 3.重組質(zhì)粒pGL3-UGBP-FL（1μg，2μg，4μg）轉(zhuǎn)染NIH3T3和HBE細(xì)胞，2μg質(zhì)粒組的UGBP啟動子活性高于1μg組和4μg組(p＜0.05;)。
　　 4.TGF-β1(5 ng/ml)作用于HBE細(xì)胞12h、24h，雙螢光素酶檢測啟動子活性結(jié)果顯示:TGF-β1增強(qiáng)了UGBP的啟動子活性（12 h組與報(bào)

5、告基因組比較，p＜0.05;24 h組與報(bào)告基因組相比，p＜0.01;報(bào)告基因組與對照比較，p＜0.01）。
　　 5.TGF-β1(10 ng/ml)作用于NIH3T3細(xì)胞雙螢光素酶檢測啟動子活性結(jié)果顯示:TGF-β1增強(qiáng)了UGBP的啟動子活性(p＜0.01)。
　　 6.SIS3(3μ mol/L)預(yù)處理可以減輕TGF-β1對UGBP啟動子活性的影響，SIS3+TGF-β1組與TGF-β1組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.

6、05)。
　　 7.雙螢光素酶檢測啟動子活性結(jié)果顯示:質(zhì)粒pGL3-UGBP-321轉(zhuǎn)染HBE細(xì)胞48 h UGBP啟動子活性較強(qiáng)，pGL3-UGBP-321質(zhì)粒組與pGL3-UGBP-FL質(zhì)粒組相比較沒有顯著差異(P＞0.05);pGL3-UGBP-321質(zhì)粒組與對照組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建并鑒定了一系列UGBP基因5’側(cè)翼啟動子區(qū)不同長度片段螢光素酶報(bào)告基因載體