BACE1基因啟動子核心區(qū)域的研究.pdf

1、目的:確定BACE1基因啟動子的核心區(qū)域，尋找對于BACE1基因的轉錄起著關鍵作用的順式作用元件和最小啟動子區(qū)域，揭示BACE1基因核心啟動子的結構并研究相應的功能。
　　方法:在前期研究的基礎上繼續(xù)構建含有不同區(qū)域的BACE1基因啟動子-熒光素酶報告基因載體。用常規(guī)方法培養(yǎng)人胚腎細胞HEK293，用Invitrogen公司的轉染試劑Lipofectamine2000將構建的含有不同區(qū)域的BACE1基因啟動子-熒光素酶報告基因載體

2、轉染HEK293并使其在細胞內表達熒光素酶。用Promega公司的雙熒光素酶檢測試劑測定細胞裂解液熒光素酶的活性并用內參照載體的活性進行校準，最終活性比值反映BACE1基因啟動子的活性，然后比較其活性在不同載體之間的差異，確定具有啟動子活性的最小區(qū)域的5'端邊界和3'端邊界。在此基礎上，以p3BU-1149/-400或p3BU-583/-400為模板，通過基因定點突變確定BACE1候選順式作用元件的核心序列，通過構建相應的反向突變質粒來

3、驗證順式作用元件的功能，并研究各順式作用元件間的相互作用。
　　結果:成功構建一系列含有不同區(qū)域的BACE1基因啟動子-熒光素酶報告基因載體，最長的插入片段為874bp，包含BACE1的翻譯起始位點上游1273到400的序列，即B1U-1273/-400，繼續(xù)刪切并轉染，5'刪切分析發(fā)現(xiàn)-583/-574和-560/-540這兩個區(qū)域有可能含有啟動子功能發(fā)揮所需的元件。3'刪切分析發(fā)現(xiàn)-480可能是BACE1啟動子活性所必需的。-

4、510/-480對于BACE1的啟動子活性起著關鍵作用。-550/-480可能是BACE1基因的啟動子核心區(qū)域。通過基因定點突變發(fā)現(xiàn)578G/A，510A/C附近各存在一個功能性的順式作用元件區(qū)域而且各順式作用元件在影響B(tài)ACE1啟動子活性方面具有協(xié)同作用，將這兩個順式作用元件序列分別命名為TCE1，TCE2，TCE1是一個高度保守的近端激活因子，TCE1與核心啟動子之間間隔的堿基個數而不是堿基的種類對基因的轉錄有重要作用，TCE2與B

5、ACE1的基礎轉錄密切相關。通過查詢數據庫及5'RACE的結果發(fā)現(xiàn)BACE1的核心啟動子區(qū)域不含有任何已知的經典核心啟動子元件。
　　結論:通過實驗已經成功找到了BACE1基因啟動子的核心區(qū)域，而且確定了兩個控制BACE1轉錄的關鍵元件TCE1，TCE2，這兩個元件可以相互作用，其中TCE1是一個高度保守的近端激活因子，TCE2與BACE1的基礎轉錄密切相關。最終發(fā)現(xiàn)BACE1的核心啟動子區(qū)域不含有任何已知的經典核心啟動子元件，這