建立作用于CCR5啟動(dòng)子的藥物篩選方法及初步應(yīng)用.pdf

1、背景和目的:獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染引起的。HIV進(jìn)入CD4~+細(xì)胞是由于病毒衣殼糖蛋白、CD4受體與趨化因子受體相互作用完成的。初始感染的HIV-1病毒株結(jié)合的是趨化因子受體5(CC-chemokine receptor5,CCR5),而在感染后期的HIV-1 X4毒

2、株,則結(jié)合趨化因子受體CXCR4(CXC-chemokine receptor4,CXCR4)。結(jié)構(gòu)正常的CCR5蛋白質(zhì)起到促進(jìn)HIV入胞的通道蛋白的功能。因此,CCR5是HIV感染初期最重要的輔助受體。近年來(lái),對(duì)CCR5基因多態(tài)性的研究引起許多學(xué)者的興趣,其中CCR5△32和CCR5m303純合子的個(gè)體能有效地抵抗HIV-1對(duì)人體的感染,CCR5基因多態(tài)性對(duì)AIDS發(fā)病的影響從側(cè)面證明CCR5在HIV-1感染和致病過(guò)程中的重要性。越來(lái)

3、越多的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,CCR5△32個(gè)體擁有正常的免疫功能和炎癥反應(yīng),并且對(duì)HIV-1的感染表現(xiàn)出顯著的抵御能力。因此在理論上,可以通過(guò)作用于CCR5的promoter,降低CCR5基因的表達(dá)來(lái)預(yù)防和治療HIV感染。國(guó)外已有許多關(guān)于CCR5拮抗劑的研究,有些藥物已處于Ⅱ期臨床研究階段。中醫(yī)藥治療具有藥源豐富、價(jià)格低廉、毒副作用小以及能提高機(jī)體免疫功能等特點(diǎn),那么,中藥是否可以通過(guò)作用于CCR5基因的promoter來(lái)發(fā)揮抗HIV/AI

4、DS作用?為此,本實(shí)驗(yàn)擬建立一種方法,篩選作用于CCR5 promoter的具有潛在抗HIV/AIDS作用的中藥。先將CCR5的promoter重組到螢光素酶報(bào)告基因載體pGL3-neo的螢光素酶報(bào)告基因上游;轉(zhuǎn)染并篩選得到一組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有上述重組載體的Jurkat(急性淋巴瘤細(xì)胞)細(xì)胞株;然后選取7種中藥分別作用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因螢光素酶的活性反映CCR5啟動(dòng)子活性,分析7種中藥對(duì)CCR5基因啟動(dòng)子的影響,建立作用于HI

5、V輔助受體CCR5啟動(dòng)子的抗HIV/AIDS藥物體外篩選方法。
　　方法:設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增CCR5啟動(dòng)子的引物,從人基因組DNA中PCR擴(kuò)增CCR5的啟動(dòng)子基因序列。改建螢光素酶報(bào)告載體pGL3,設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增抗性篩選標(biāo)記neo單元的引物,從pcDNA3.1質(zhì)粒中PCR擴(kuò)增neo單元,將neo單元克隆入T載體(pGEM-T-neo),酶切鑒定證實(shí)無(wú)誤后,將neo插入質(zhì)粒pGL3中,PCR鑒定篩選正向插入克隆;將CCR5啟動(dòng)子基因片段

6、克隆入T載體(pGEM-T-CCR5),再亞克隆入質(zhì)粒pGL3-neo,雙酶切、PCR和測(cè)序分析鑒定螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒:pGL3-neo-CCR5。脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染pGL3-neo-CCR5入Jurkat細(xì)胞(急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞),G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,擴(kuò)大培養(yǎng)后分組。使用7種中藥(雙黃連、川琥寧、甘草、豬苓、桔梗、黃芪、黃芩)分別作用于各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞16h后,通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因螢光素酶活性反映中藥對(duì)CCR5啟動(dòng)子的作用。結(jié)

7、果數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0分析。
　　結(jié)果:1.PCR擴(kuò)增CCR5啟動(dòng)子基因片段,電泳可見(jiàn)987bp處有明亮條帶,與設(shè)計(jì)一致。2.PCR擴(kuò)增neo單元,電泳可見(jiàn)1882bp處有明亮條帶,與設(shè)計(jì)一致。3.將neo單元、CCR5啟動(dòng)子基因片段分別與pGEM-T Easy連接后,轉(zhuǎn)化DH5α,篩選鑒定后得到重組子pGEM-T-neo、重組子pGEM-T-CCR5。4.將neo單元插入螢光素酶報(bào)告載體pGL3,得到帶有篩選標(biāo)記的報(bào)

8、告基因載體pGL3-neo。5.將CCR5啟動(dòng)子基因片段亞克隆入pGL3-neo,得到螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-neo-CCR5,雙酶切、PCR鑒定證明插入序列正確。DNA序列測(cè)序,結(jié)果與設(shè)計(jì)完全一致。6.G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGL3-neo-CCR5細(xì)胞株。7.螢光素酶活性檢測(cè):雙黃連可使被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的螢光素酶活性顯著降低(P<0.05),川琥寧、黃芩、黃芪可使被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的螢光素酶活性顯著升高(P<0.01)。豬苓、甘草、桔梗組細(xì)胞

9、的螢光素酶活性與不加中藥對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論:1.構(gòu)建出CCR5 Promoter的螢光素酶報(bào)告基因載體,G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染上述載體的細(xì)胞株,建立起作用于CCR5 promoter的藥物體外篩選方法。2.雙黃連可抑制體外培養(yǎng)細(xì)胞中CCR5啟動(dòng)子的活性,具有潛在的抗HIV/AIDS作用;川琥寧、黃芩、黃芪可使體外培養(yǎng)細(xì)胞CCR5啟動(dòng)子活性增高,提示HIV感染者不宜使用這些藥物和含有這些成分的