RIG-I基因剔除小鼠模型的建立及其生物學(xué)功能的初步研究.pdf

1、上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文RIGI基因剔除小鼠模型的建立及其生物學(xué)功能的初步研究姓名：孫岳平申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：分子遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：王鑄鋼20040501上海第二醫(yī)科大學(xué)博士生畢業(yè)論文臂，兩臂之間的基因組DNA長(zhǎng)約7kb，包括mRIGI蛋白兩個(gè)重要功能域A和B的編碼區(qū)。將此載體線性化后再用電穿孔方法將其導(dǎo)入ES細(xì)胞，篩選G418和Ganciclovir抵抗的雙陽(yáng)性克隆，并經(jīng)Southern雜交鑒定，獲得2個(gè)發(fā)生正確同源重組的ES細(xì)

2、胞克隆。將同源重組的ES細(xì)胞通過(guò)顯微注射方法導(dǎo)入C57BL／6小鼠囊胚，然后植入假孕鼠子宮。最后得到2只嵌合體雄性小鼠。將嵌合體小鼠與129S3野生型小鼠回交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有514嵌合體小鼠能夠產(chǎn)生灰色的后代。對(duì)這些灰色的仔鼠進(jìn)行基因型分析，篩選到攜帶RIGI基因突變的雜合子后代。從這些雜合子小鼠相互交配產(chǎn)生的后代中，我們又獲得了純合的RIGI基因剔除小鼠。RTPCR實(shí)驗(yàn)表明，在純合子小鼠中檢測(cè)不到RIGImRNA的表達(dá)。在基因剔除小鼠模

3、型構(gòu)建的同時(shí)，我們還對(duì)已有的但不完整的小鼠RIGIeDNA序剄進(jìn)行了進(jìn)一步的克隆。通過(guò)電子克隆拼接，PCR以及測(cè)序驗(yàn)證，獲得了帶有完整讀碼框的小鼠RIGIcDNA。RIGI基因定位于小鼠的第4號(hào)染色體，有18個(gè)外顯子。cDNA全長(zhǎng)約3900bp，編碼926個(gè)氨基酸。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)小鼠的RIGI蛋白與人的RIGI蛋白高度同源，同源性高達(dá)81％。RTPCR和Northern印跡分析顯示，小鼠的RIGI主要在心、脾、肺、肝、腎、胃和骨髓等組織表達(dá)

4、，且可能存在兩種剪接方式。對(duì)RIGI基因剔除小鼠的袁型分析首先從檢查雜舍子小鼠后代三種基因型(RIGI“、RIGI州‘、RIGI?！?的比例開(kāi)始，雜合子小鼠相互交配后，其后代基因型經(jīng)鑒定證實(shí)符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，表明RIGI小小鼠胚胎發(fā)育正常。三種基因型的新生小鼠在形態(tài)、重量、繁殖能力等方面也未見(jiàn)明顯的差異。由于RIGI基因可能參與粒系細(xì)胞的分化，因此我們定期對(duì)三種基因型小鼠的外周血相以及骨髓血相進(jìn)行檢查。血細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)儀對(duì)外周血分類(lèi)計(jì)數(shù)