RIG-I在機(jī)體免疫反應(yīng)中的作用及其機(jī)制初步研究.pdf

1、RIG-I(Retinoic acid-inducible gene I)是全反式維甲酸ATRA（all trans-retinoic acid）誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化過程中克隆到的一個(gè)上調(diào)基因，在抗病毒反應(yīng)中起重要作用。 本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了RIG-I基因剔除小鼠模型，并對(duì)其進(jìn)行表型分析，發(fā)現(xiàn)該基因與T淋巴細(xì)胞自穩(wěn)狀態(tài)維持和免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換相關(guān)。 和野生型小鼠相比，隨年齡的增加，RIG-I基因剔除小鼠體重逐漸減輕，到3個(gè)月時(shí)出

2、現(xiàn)顯著性差異；對(duì)其各組織器官進(jìn)行病理分析，結(jié)果顯示RIG-I基因剔除小鼠的胃腸出現(xiàn)不同程度的炎癥細(xì)胞侵潤，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示3月齡的RIG-I基因剔除小鼠均出現(xiàn)巨大肥厚性胃炎，2月齡的RIG-I基因剔除小鼠70％出現(xiàn)自發(fā)性腸炎樣癥狀，并隨著年齡增加侵潤程度逐步增加；菌群分析顯示RIG-I基因剔除小鼠腸道粘膜菌群改變；RIG-I基因剔除小鼠小腸的淋巴器官Peyer’s Patch的數(shù)目顯著減少、體積顯著減??；TUNEL和流式分析結(jié)果顯示RIG-I

3、基因剔除小鼠的Peyer’s Patch細(xì)胞凋亡增加，但OVA(卵清白蛋白)免疫后Peyer’s Patch生發(fā)中心正常形成；RIG-I基因剔除小鼠比野生型小鼠對(duì)DSS（Dextran sulfate sodium salt）易感性顯著性增加。以上結(jié)果提示RIG-I基因剔除小鼠存在顯著的免疫缺陷癥狀，本實(shí)驗(yàn)對(duì)與機(jī)體炎癥反應(yīng)關(guān)系密切的T細(xì)胞做進(jìn)一步的研究。 利用ELISA進(jìn)一步分析RIG-I基因剔除小鼠免疫系統(tǒng)各個(gè)細(xì)胞類型功能學(xué)變

4、化。檢測(cè)RIG-I基因剔除小鼠和野生型小鼠的脾臟細(xì)胞體外培養(yǎng)的上清，基礎(chǔ)狀態(tài)下，RIG-I基因剔除小鼠脾臟細(xì)胞IFN-γ分泌比野生型小鼠高2.5倍，IL-10沒有顯著性變化；PMA體外刺激培養(yǎng)三天后，RIG-I基因剔除小鼠脾臟細(xì)胞IFN-γ分泌比野生型小鼠高14倍，LPS刺激下IL-10分泌也顯著增加，IL-4未見顯著性改變，表明RIG-I基因剔除小鼠的脾臟細(xì)胞因子分泌發(fā)生改變；RIG-I基因剔除小鼠的T細(xì)胞亞群流式分析結(jié)果表明RIG-

5、I基因缺失沒有影響T細(xì)胞在胸腺中的發(fā)育；脾臟總的CD4＋、CD8＋的T細(xì)胞數(shù)量和比例未見顯著性改變，但RIG-I基因剔除小鼠中CD4＋T細(xì)胞中初始T細(xì)胞（CD44lowCD62Lhigh）細(xì)胞比例明顯降低，CD44lowCD62LlowT細(xì)胞、效應(yīng)性T細(xì)胞（CD44highCD62Llow）、記憶性T細(xì)胞（CD44highCD62Lhigh）顯著性增加；CD8＋T細(xì)胞中初始T細(xì)胞（CD44lowCD62Lhigh）比例顯著性降低，效應(yīng)性

6、T細(xì)胞（CD44highCD62Llow）比例比野生型小鼠也有顯著性升高，而雙陽性和雙陰性細(xì)胞沒有顯著性變化；TUNEL和流式結(jié)果顯示脾臟T細(xì)胞凋亡增加；胸腺和脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在數(shù)目和比例上沒有顯著性差異，但是體外抑制實(shí)驗(yàn)表明RIG-I基因剔除小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4+CD25+功能缺陷。 Gαi2( G pretein α inhibitory subunit)是G蛋白家族的成員之一，Gαi2基因剔除小鼠和RIG-I基因剔除

7、小鼠表型有很大的相似性，提示RIG-I和 Gαi2之間的相關(guān)性。RIG-I基因剔除小鼠各組織器官中Gαi2有不同程度的表達(dá)降低；NB4細(xì)胞中，隨著ATRA誘導(dǎo)RIG-I基因的表達(dá)增加，Gαi2亦出現(xiàn)相應(yīng)的表達(dá)增加；Luciferase實(shí)驗(yàn)也表明RIG-I對(duì)Gαi2的啟動(dòng)子區(qū)域有正向的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。同時(shí)Luciferase實(shí)驗(yàn)也提示RIG-I負(fù)向調(diào)控Blimp-1(B lymphocyte induced maturation prote

8、in-1)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。以上結(jié)果提示RIG-I可能通過調(diào)節(jié)Gαi2和Blimp-1的轉(zhuǎn)錄，改變T細(xì)胞在外周的免疫自穩(wěn)狀態(tài)，從而導(dǎo)致RIG-I基因剔除小鼠胃腸炎的發(fā)生。 前期工作表明RIG-I基因剔除小鼠免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換出現(xiàn)異常，本研究建立了RIG-I高表達(dá)B細(xì)胞株1B4.B6/ pcDNA3.1-RIG-I，以期進(jìn)一步闡明RIG-I在免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換中的作用及其分子機(jī)制。 用LPS刺激1B4.B6/ pcDNA3.1

9、-RIG-I 和對(duì)照細(xì)胞株1B4.B6/pcDNA3.1不同的時(shí)間段，并對(duì)各種免疫球蛋白的胚系轉(zhuǎn)錄本和類別轉(zhuǎn)換后轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明刺激前后IgM胚系轉(zhuǎn)錄本在兩種細(xì)胞株中沒有顯著差異，在RIG-I高表達(dá)的細(xì)胞株中IgG1、IgG3胚系轉(zhuǎn)錄本增強(qiáng)，IgG3類別轉(zhuǎn)換后轉(zhuǎn)錄本顯著性增強(qiáng)；p50 在IgG3類別轉(zhuǎn)化事件中起關(guān)鍵性作用，檢測(cè)結(jié)果顯示和對(duì)照細(xì)胞株相比，1B4.B6/ pcDNA3.1-RIG-I細(xì)胞中p50蛋白水平增強(qiáng)，提示R

10、IG-I對(duì)p50蛋白水平有調(diào)節(jié)作用；免疫共沉淀顯示RIG-I蛋白和p50蛋白之間存在相互作用；RIG-I主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，EGFP示蹤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RIG-I也存在細(xì)胞核中；RIG-I過表達(dá)使1B4.B6細(xì)胞中CD138單陽性細(xì)胞的比例降低，但CD138+細(xì)胞中分泌IgG3的細(xì)胞比例顯著增加；MTT結(jié)果顯示RIG-I抑制1B4.B6細(xì)胞的增殖；流式結(jié)果同樣顯示RIG-I基因高表達(dá)改變細(xì)胞生長周期。本部分研究顯示RIG-I高表達(dá)上調(diào)p50蛋白

11、水平并和其相互作用促進(jìn)免疫球蛋白IgG3類別轉(zhuǎn)換事件的發(fā)生。同時(shí)顯示RIG-I高表達(dá)增強(qiáng)B細(xì)胞分泌IgG3的能力不是通過加快細(xì)胞增殖來完成的。 進(jìn)一步對(duì)RIG-I基因剔除小鼠骨髓細(xì)胞基因芯片結(jié)果分析表明RIG-I基因的缺失引起免疫防御、細(xì)胞周期、免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換、物質(zhì)代謝等方面基因的轉(zhuǎn)錄改變，對(duì)RIG-I基因剔除小鼠的相應(yīng)表型可以做一定的解釋。 本研究首次報(bào)道RIG-I基因在T淋巴細(xì)胞自穩(wěn)狀態(tài)維持和免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換事