MicroRNA調(diào)控鮸魚RIG-I信號(hào)通路及功能分析.pdf

1、天然免疫系統(tǒng)又稱固有免疫系統(tǒng)，作為抵抗病原微生物的第一道防線對(duì)保護(hù)宿主免受侵染發(fā)揮著重要的作用，也逐漸成為免疫學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。目前，一系列的模式識(shí)別受體已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，并對(duì)其識(shí)別分子機(jī)制進(jìn)行了研究。RIG-Ⅰ樣解旋酶受體是一類位于胞內(nèi)的抗病毒模式識(shí)別受體，通過(guò)RIG-Ⅰ信號(hào)通路傳遞信號(hào)最終引起抗病毒免疫反應(yīng)。目前大部分研究集中在免疫應(yīng)答模式，以及基因和信號(hào)通路的研究，而對(duì)于免疫調(diào)控機(jī)制的研究還不夠系統(tǒng)和完善。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)microRNA(

2、miRNA)具有重要的調(diào)控功能，參與生命體多種活動(dòng)的調(diào)節(jié)，如生物體生長(zhǎng)發(fā)育，細(xì)胞繁殖，細(xì)胞凋亡及免疫活動(dòng)等。因此在本文中我們通過(guò)構(gòu)建small RNA文庫(kù)，分析miRNA通過(guò)調(diào)控RIG-Ⅰ信號(hào)通路來(lái)參與抗病毒免疫調(diào)節(jié)，并進(jìn)一步分析了miR-145通過(guò)靶向MDA5來(lái)進(jìn)行抗病毒免疫的調(diào)節(jié)，得到的主要研究結(jié)論如下:
　　1.通過(guò)Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)來(lái)自對(duì)照組(control group，CG)與感染組(infected gr

3、oup，IG)的樣本進(jìn)行測(cè)序獲得兩個(gè)small RNA轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)。經(jīng)過(guò)篩選12，052，153和11，150，433條clean reads從對(duì)照組和感染組獲得。通過(guò)blast將獲得的clean reads與miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從對(duì)照組和感染組數(shù)據(jù)庫(kù)分別鑒定出219和217種已知miRNA用于后續(xù)分析。對(duì)基因組序列上未被注釋的sRNAs進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分別在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定出75和69種novel miRNA。
　　2.比

4、較兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中共有miRNA的表達(dá)量變化情況，發(fā)現(xiàn)poly(I∶C)刺激后14個(gè)已知miRNA和8個(gè)novel miRNA表達(dá)量發(fā)生了顯著變化。其中已知的表達(dá)顯著差異的miRNA中有9個(gè)顯著上升，5個(gè)miRNA表達(dá)量是顯著下降的。在8個(gè)表達(dá)量顯著變化的novel miRNA中，有2個(gè)表達(dá)量顯著上升，而其他6個(gè)表達(dá)量顯著下降。為驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫(kù)表達(dá)量分析的可信性，我們隨機(jī)挑選了四個(gè)表達(dá)量顯著差異的miRNA:miR-132，miR-155，mi

5、R-181，miR-190進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)表達(dá)量變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量分析與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果一致，證明高通量測(cè)序數(shù)據(jù)是可信。
　　3.研究表明miRNA通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)量來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)各種生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)。本文中我們對(duì)表達(dá)量發(fā)生顯著變化的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，用來(lái)分析miRNA的免疫調(diào)控。其中來(lái)自RIG-Ⅰ信號(hào)通路的基因:NLRX1，JNK，IRF3和CASP8等被識(shí)別為miRNA的靶基因，差異表達(dá)miRN

6、A通過(guò)調(diào)控這些基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)RIG-Ⅰ信號(hào)通路的調(diào)控。我們還通過(guò)分析miRNA與其對(duì)應(yīng)靶基因的表達(dá)量了解miRNA對(duì)靶基因的負(fù)調(diào)控模式。這些研究為將來(lái)的魚類miRNA免疫調(diào)控研究提供數(shù)據(jù)。
　　4.RIG-Ⅰ樣解旋酶受體(RIG-Ⅰ like receptors，RLRs)是一類胞內(nèi)病毒識(shí)別模式受體。RLR家族包含三個(gè)基因:維甲酸誘導(dǎo)基因-Ⅰ(retinoic acid induced geneⅠ，RIG-Ⅰ)、黑色素瘤分化相

7、關(guān)基因5(melanoma differentiation associated gene5，MDA5)和LGP2(laboratory of genetics and physiology2)。其中RIG-Ⅰ基因在很多魚類物種中發(fā)生了丟失，LGP2由于缺少CARD結(jié)構(gòu)域不能夠激活下游因子引發(fā)抗病毒免疫反應(yīng)。因此MDA5在魚類病毒識(shí)別中具有非常重要的意義，了解MDA5的調(diào)控機(jī)制也非常重要。在本文中，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)得出MDA5是miR-1

8、45的靶基因，進(jìn)一步使用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行了驗(yàn)證，并利用靶位點(diǎn)突變的方法確認(rèn)了miR-145在MDA5上的靶識(shí)別位點(diǎn)。利用miR-145-5p模擬體和miR-145前體重組質(zhì)粒(pre-miR-145)進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，結(jié)果表明了MDA5為miR-145的靶基因，并且miRNA的敲降作用表現(xiàn)出濃度依賴和時(shí)間依賴的特性。本文還分析了poly(I∶C)感染不同時(shí)間后miR-145-5p和MDA5在肝臟和腎臟中的表達(dá)量，表明