金欣口服液對RSV誘導的TLR3-RIG-I信號通路的調(diào)控作用的研究.pdf

1、研究目的:
　　通過檢測金欣口服液干預(yù)后，RSV誘導的TLR3/RIG-Ⅰ信號通路關(guān)鍵分子表達情況，分析金欣口服液在治療小兒感染RSV后所致肺炎的發(fā)病及治療機制。
　　研究方法:
　　1.體外實驗研究:
　　1.1 RSV感染Raw264.7細胞后間斷2h連續(xù)采樣，Real time RT-PCR法檢測TLR3、IRF3和IRF3 mRNA表達的變化趨勢;
　　1.2 RSV感染Raw264.7細胞后，將處

2、理后的金欣口服液加入細胞內(nèi)進行干預(yù)，RSV感染12h后，裂解細胞，探針法Real time RT-PCR法檢測細胞內(nèi)病毒載量。
　　1.3 RSV感染Raw264.7細胞后，金欣口服液含藥血清進行干預(yù)，RSV接種12h后收集細胞上清液和細胞，Real time RT-PCR法檢測TLR3、RIG-Ⅰ、IPS-Ⅰ、TRAF3、TBK1、IRF3、IFN-β、SOCS1 mRNA的表達情況;Western blot法檢測TLR3、RI

3、G-Ⅰ、IPS-Ⅰ、TRAF3、TBK1、IRF3（P-IRF3）、IFN-β、SOCS1蛋白的表達情況;激光共聚焦顯微鏡檢測TLR3蛋白表達情況;ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液中IFN-β的表達情況。
　　1.4熒光標記的siRNA轉(zhuǎn)染Raw264.7細胞，流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。在MyD88基因干擾條件下，RSV感染Raw264.7細胞，予處理后的金欣口服液加入細胞內(nèi)進行干預(yù)，RSV感染12h后，裂解細胞，Real time RT

4、-PCR法和Western blot法檢測各組細胞MyD88、IRF3(P-IRF3)、NF-κB mRNA和蛋白的表達情況。
　　2.體內(nèi)實驗研究:
　　2.1 RSV通過滴鼻接種BALB/c小鼠，不同劑量金欣口服液和利巴韋林進行干預(yù)，在第一次接種呼吸道合胞病毒后2d、4d、7d，取小鼠肺組織研磨勻漿后，探針法Real timeRT-PCR法檢測肺組織中病毒載量。
　　2.2 RSV通過滴鼻接種BALB/c小鼠，不同

5、劑量金欣口服液和利巴韋林進行干預(yù)，在第一次接種呼吸道合胞病毒后2d、4d、7d，取小鼠肺組織和肺泡灌洗液;經(jīng)病理檢查相關(guān)處理后，觀察肺部病變情況，Real time RT-PCR法檢測TLR3、RIG-Ⅰ、IPS-Ⅰ、TRAF3、TBK1、IRF3、IFN-β、SOCS1 mRNA表達情況，Western blot法檢測各組小鼠肺組織TLR3、RIG-Ⅰ、IPS-Ⅰ、 TRAF3、 TBK1、IRF3(P-IRF3)、IFN-β、 SO

6、CS1蛋白表達情況;ELISA法檢測小鼠肺泡灌洗液IFN-β表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.體外實驗:
　　1.1 Raw264.7細胞在感染RSV24h內(nèi)，TLR3、IRF3和IFN-β mRNA出現(xiàn)了先增高后降低的表達趨勢，TLR3 mRNA在RSV感染12-14h表達量達到最高值，IRF3 mRNA在RSV感染后10-12h表達量達到峰值，IFN-β在RSV感染后12-16h達到峰值。
　　1.2 RSV感

7、染Raw264.7細胞12h后，金欣口服液能夠顯著降低Raw264.7細胞內(nèi)病毒載量（P＜0.01）。
　　1.3 金欣口服液可顯著上調(diào)TRAF3 mRNA的表達(P＜0.01);模型組SOCS1 mRNA表達顯著降低，金欣口服液可顯著上調(diào)SOCS1的低表達。
　　1.4 RSV感染Raw264.7細胞12后，TRAF3表達無顯著變化（P＞0.05），金欣口服液對其有下調(diào)作用(P＜0.05);模型組SOCS1蛋白表達顯著降低

8、，金欣口服液可顯著上調(diào)SOCS1的低表達。
　　1.5 MyD88基因干擾后，在mRNA和蛋白水平上，正常組IRF3表達量無顯著變化(P＞0.05)，阻斷模型組與模型組相比無顯著變化(P＞0.05)，阻斷造模后的藥物干預(yù)組亦無顯著變化(P＞0.05);但在MyD88基因干擾后，NF-κB的表達顯著降低(P＜0.01)，RSV感染后模型組與基因干擾后的模型組相比也顯著降低(P＜0.01)，金欣口服液干預(yù)后未能改變此種改變(P＞0.0

9、5)。
　　2.體內(nèi)試驗:
　　2.1 RSV感染2d后，模型組小鼠肺組織RSV病毒載量明顯增高，金欣口服液不同劑量組均能降低病毒載量(P＜0.01)，兩者之間無顯著差異(P＞0.05)。RSV感染4d后，模型組小鼠肺組織內(nèi)病毒載量較感染后2d明顯增高(P＜0.01)，金欣口服液不同劑量均能顯著降低病毒載量(P＜0.01)，金欣口服液高劑量組對RSV擴增抑制效應(yīng)最明顯(P＜0.01)。與感染后4d相比，RSV感染7d后病毒載

10、量顯著降低(P＜0.01)，與模型組相比，金欣口服液不同劑量組均能降低小鼠肺組織內(nèi)的病毒載量(P＜0.01)，兩者之間無顯著差異。
　　2.2 RSV感染2d后，模型組肺組織病理評分與正常組相比有顯著差異(P＜0.01)，金欣口服液不同劑量能夠顯著減輕肺組織病理改變(P＜0.01)，金欣口服液低劑量尤顯著(P＜0.01)。RSV感染4d后，模型組肺組織病理評分較感染后2d加重(P＜0.01)，金欣口服液不同劑量組均可顯著減輕病理改

11、變(P＜0.01)，金欣口服液高劑量組更顯著(P＜0.01)。RSV感染7d后，模型組肺組織病理評分較感染后4d加劇(P＜0.01)，金欣口服液不同劑量組均可顯著減輕(P＜0.01)，金欣口服液高劑量組在減輕肺組織病變方面更明顯(P＜0.01)。
　　2.3 模型組小鼠肺組織中TBK1蛋白表達具有顯著下調(diào)作用(P＜0.01)，金欣口服液高劑量組對TBK1蛋白表達具有顯著下調(diào)作用(P＜0.01)，而金欣口服液低劑量組對TBK1蛋白表

12、達具有顯著上調(diào)作用（P＜0.01）。
　　2.4 金欣口服液不同劑量對TLR3、RIG-Ⅰ、IPS-Ⅰ、TRAF3、TBK1、P-IRF3、SOCS1、IFN-β蛋白的高表達均有顯著下調(diào)作用(P＜0.01);模型組小鼠肺組織中IRF3蛋白表達無顯著變化（P＞0.05），金欣口服液不同劑量組對IRF3蛋白表達亦無調(diào)控作用(P＞0.05)。
　　2.5 金欣口服液不同劑量對TLR3、RIG-Ⅰ、IPS-Ⅰ、TRAF3、P-IRF

13、3、IFN-β蛋白的低表達均有顯著上調(diào)作用(P＜0.01)，但金欣口服液不同劑量對SOCS1蛋白具有下調(diào)作用(P＜0.01);模型組小鼠肺組織中TBK1、IRF3蛋白表達無顯著變化(P＞0.05)，金欣口服液不同劑量組對IRF3蛋白表達無調(diào)控作用(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)金欣口服液能夠顯著降低RSV感染Raw264.7細胞和BALB/c小鼠肺組織內(nèi)的病毒載量，具有直接抑制RSV增殖的。
　　(2)金欣口

14、服液能夠明顯減輕RSV感染BALB/c小鼠肺組織病理變化，能夠減輕肺泡壁的充血、水腫，減輕中性粒細胞、淋巴細胞和單核巨噬細胞的浸潤，減少代償性肺氣腫等。
　　(3)RSV感染Raw264.7細胞24h內(nèi)，被RSV激活的TLR3信號通路的關(guān)鍵分子TLR3、IRF3、IFN-β轉(zhuǎn)錄水平上呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，在感染后10-14h是TLR3、IRF3、IFN-β表達的高峰期。
　　(4)通過超高效液相技術(shù)分析了金欣口服液主要化學

15、組分，主要包括芥子堿硫氰酸鹽、虎杖苷、野黃芩、白藜蘆醇、黃芩苷、大黃素-8-O-β-葡萄糖苷、黃芩素、漢黃芩素等。
　　(5) RSV感染能夠誘導TLR3/RIG-Ⅰ信號通路的激活，其中信號通路關(guān)鍵分子TLR3、RIG-Ⅰ、IPS-Ⅰ、TRAF3、TBK1、IRF3(P-IRF3)在RSV感染初期基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達均顯著增高，而在感染后期又呈現(xiàn)顯著降低，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。金欣口服液在RSV感染早期能夠顯著抑制TLR3

16、/RIG-Ⅰ信號通路的激活，顯著降低TLR3信號通路關(guān)鍵分子TLR3、RIG-Ⅰ、IPS-Ⅰ、TRAF3、TBK1、IRF3(P-IRF3)的表達，而在感染后期又能促進TLR3信號關(guān)鍵分子表達增高。
　　(6) RSV能夠誘導TLR3信號通路負調(diào)控因子SOCS1的表達，但隨著感染時間延長，SOCS1表達逐漸降低。金欣口服液能夠持續(xù)抑制SOCS1的表達，減輕SOCS1對TLR3信號通路的抑制效應(yīng)。
　　(7) RSV能夠誘導I

17、FN-β的產(chǎn)生，在RSV感染早期表達量顯著增高，在感染后期則表達量顯著降低。金欣口服液能夠在感染早期抑制IFN-β的過度表達，減輕因細胞因子過度表達引起的炎癥損傷;在感染后期金欣口服液又可促進IFN-β的表達，持續(xù)維持其抗病毒效應(yīng)。
　　(8) MyD88基因干擾后，RSV誘導的IRF3表達未受到明顯影響，但NF-κB的表達顯著降低，金欣口服液干預(yù)后未能改變此種改變，因此可認為MyD88基因干擾后對TLR3信號通路正常信號轉(zhuǎn)導未產(chǎn)