Rab7基因沉默調(diào)控巨噬細(xì)胞中TLR4-TLR3信號(hào)通路的研究.pdf

1、Toll樣受體家族(Toll-like receptor，TLRs)識(shí)別病原體相關(guān)的分子模式(PAMPs)后激發(fā)天然免疫反應(yīng)，它也是連接天然免疫和獲得性免疫的樞紐。TLRs的活化有兩面性，一方面 TLRs正常活化可以啟動(dòng)天然免疫和獲得性免疫，達(dá)到有效清除病原微生物的作用；另一方面 TLRs的異?；蜻^(guò)度活化可能引起全身炎癥相關(guān)病變。Rab7是 Rabs家族一個(gè)重要成員，主要定位在晚期內(nèi)體/溶酶體相關(guān)的細(xì)胞器上，能調(diào)節(jié)早期內(nèi)體到晚期內(nèi)體的轉(zhuǎn)

2、運(yùn)或早晚期內(nèi)體的融合，以及可能調(diào)節(jié)囊泡運(yùn)輸?shù)母鱾€(gè)環(huán)節(jié)，最近的研究也表明 Rab7也可能調(diào)節(jié)細(xì)胞跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本文旨在研究 Rab7沉默后在LPS和PolyI:C的刺激下對(duì)RAW264.7分泌細(xì)胞因子的影響，從而探討Rab7對(duì) TLR4/TLR3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控作用。我們首先設(shè)計(jì)并合成了 Rab7-siRNA干擾序列，用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到 RAW264.7細(xì)胞中，然后通過(guò) Real-time PCR和Western blot的方法檢測(cè)干擾

3、效果，另外還通過(guò) MTT法分析 Rab7基因沉默對(duì) RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的影響。之后，以 LPS和PolyI:C刺激 RAW264.7細(xì)胞不同時(shí)間，我們通過(guò) RT-PCR和Real-time PCR方法檢測(cè)了細(xì)胞因子的表達(dá)變化。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染 Rab7-siRNA-3后，Rab7的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著降低(p<0.05)，并且 Rab7基因沉默能顯著促進(jìn) RAW264.7細(xì)胞增殖(p<0.05)。我們還發(fā)現(xiàn) Rab7基因

4、沉默后，以 LPS刺激 RAW264.7細(xì)胞后分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-β、IP-10、NO/iNOS等細(xì)胞因子以及 TLR4的mRNA表達(dá)量明顯增加(p<0.01或 p<0.05)，其中 TNF-α、IL-1β、IL-6、 IFN-β和IP-10在6h達(dá)到最大值；而 NO和iNOS在12h達(dá)到最大值；TLR4則是4h達(dá)最大值。以 PolyI:C刺激 Rab7基因沉默的RAW264.7細(xì)胞后分泌的細(xì)胞因子 IFN-

5、β、IP-10和iNOS的表達(dá)量也有增加，但差異不顯著。綜上所述，我們成功的轉(zhuǎn)染了 Rab7-siRNA序列，并認(rèn)為 Rab7基因沉默能促進(jìn) RAW264.7的增殖，而且 Rab7可以負(fù)向調(diào)控 TLR4/TLR3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用了 Rab7-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞 RAW264.7的方式研究 Rab7對(duì) TLR4/TLR3信號(hào)通路的影響，為Rab蛋白對(duì) TLRs信號(hào)通路調(diào)控的研究提出了新的思路，并有助于為 TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相