PTEN調(diào)控LPS活化TLR4信號通路的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的： 膿毒癥是由感染引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory responsesyndrome，sIRs)，由其誘發(fā)的多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunctionsyndrome，MODS)已成為當(dāng)今外科ICU患者的首要死亡原因。然而，目前為止，我們對激發(fā)膿毒癥的細(xì)胞及分子機(jī)制和膿毒癥病人在抵御炎癥、維持自穩(wěn)方面的天然生理機(jī)制并不十分清楚，因而對膿毒癥病人并無有

2、效的治療措施。來源于G<'->菌的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可觸發(fā)典型的膿毒癥。因此，闡明LPs的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制不僅可深化認(rèn)識過度炎癥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制，更重要的是，可望為尋找其新的干預(yù)措施提供思路。 PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)是1997年發(fā)現(xiàn)的一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，在細(xì)胞分化、衰老、凋亡、粘附和遷移等

3、多種生理活動中發(fā)揮重要作用。近年來發(fā)現(xiàn)其還參與免疫細(xì)胞的發(fā)育，信號傳遞過程和維持正常免疫反應(yīng)。PTEN具有脂質(zhì)磷脂酶的活性，其主要功能是使PI(3，4，5)P<,3>的D3位點去磷酸化，從而降低細(xì)胞內(nèi)PIP<,3>的水平。而PIP3是P13K/Akt通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，PIP3的減少可降低P13K激活引起的Akt磷酸化，進(jìn)而阻斷P13K/Akt信號通路。由此可見，PTEN是P13K/Akt信號通路中的一個重要的分子開關(guān)。當(dāng)PTEN活性增強(qiáng)時

4、，P13K/Akt通路減弱，甚至關(guān)閉，而當(dāng)PTEN活性減弱時，P13K/Akt通路則增強(qiáng)。同時，作為一個雙特異性的磷酸酶，PTEN也兼有蛋白磷酸酶的功能，能使它自身、聚集黏附激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)、SHC和由生長因子受體衍生的血小板脫磷酸，抑制細(xì)胞的粘附、遷移和擴(kuò)散。目前已知，P13K是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)負(fù)向調(diào)控最關(guān)鍵的激酶之一，而且，與內(nèi)毒素耐受不同，P13K在LPS入侵機(jī)體后早期即參與了LPS誘導(dǎo)的TL

5、R4信號通路的調(diào)節(jié)，在機(jī)體免疫反應(yīng)的第一時相即發(fā)揮重要的負(fù)向調(diào)控作用。因此，人們推測，作為P13K天然的拮抗分子，PTEN是否也參與了LPS所導(dǎo)致的炎癥性反應(yīng)的調(diào)控。 最新研究顯示，LPS刺激后，PTEN<'(+/+)>小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞MAPK激酶的活性增強(qiáng)，TNF-α等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放明顯高于PTEN<'(+/+)>小鼠，提示PTEN在調(diào)控炎癥反應(yīng)中的地位非常重要。然而LPS通過何種方式與PTEN發(fā)生相互作用而調(diào)控炎癥反

6、應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，PTEN又是通過怎樣的信號通路介導(dǎo)了炎癥介質(zhì)的釋放，目前知之甚少。 為此，本研究以RAW264.7細(xì)胞株為細(xì)胞模型，首先檢測了LPS對PTEN表達(dá)、活性的影響及PTEN對炎性細(xì)胞因子TNF-α分泌的作用，以驗證PTEN是否參與了LPS活化的TLR4信號通路及對炎性因子分泌的影響。其次，檢測了PTEN對LPS誘導(dǎo)的MAPK及NF-kB活性的影響，以探明PTEN對LPS活化的TLR4信號通路作用的分子機(jī)制。然后在此基礎(chǔ)

7、上檢測了LPS刺激下，PTEN對其下游信號分子Akt磷酸化水平的影響。最后，分析了PTEN與TLR4復(fù)合受體的關(guān)系，對LPS信號通路中PTEN的上游調(diào)控進(jìn)行了初步探討。 方法： 1．采用RAW264.7細(xì)胞為細(xì)胞模型，收集不同濃度LPS刺激后8、24、48h細(xì)胞蛋白，Western Blot法檢測PTEN蛋白表達(dá)水平；收集LPS(1μg/ml)刺激后0、5、10、20、30、45、60、120min細(xì)胞蛋白，Wester

8、n Blot法檢測PTEN磷酸化水平及蛋白含量。 2．采用瞬時轉(zhuǎn)染及RNA干擾技術(shù)，下調(diào)內(nèi)源性PTEN蛋白表達(dá)，分為siRNA-PTEN組及對照的SsiRNA組，LPS刺激6h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清以ELISA法檢測TNF-α水平；另一部分實驗將RAW264.7細(xì)胞分為兩組，正常細(xì)胞組及提前1h加入PTEN抑制劑組，LPS刺激6h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA法檢測TNF-α含量。 3．RAW264.7細(xì)胞分為過表達(dá)野生型P

9、TEN組及空載體組，每組再分為未刺激及LPS(1μg/ml)刺激后15、30min組，收集細(xì)胞蛋白，Western Blot法檢測p-ERK、p-P38、P-JNK磷酸化水平及總蛋白含量；RAW264.7細(xì)胞分為兩組，正常細(xì)胞組及PTEN抑制劑組，每組再分為未刺激及LPS(1μg/ml)刺激后10、20、30、45、60min組，收集細(xì)胞蛋白，Western Blot法檢測p-ERK、p-P38、P-JNK磷酸化水平及總蛋白含量。

10、 4．RAW264．7細(xì)胞分為四組，過表達(dá)空載體組、過表達(dá)野生型PTEN組、過表達(dá)C124A-PTEN組(PTEN蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶活性雙突變)、過表達(dá)G129E-PTEN(PTEN脂質(zhì)磷酸酶活性突變)組，LPS刺激6h后雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測NF-kB轉(zhuǎn)錄活性；RAW264.7細(xì)胞分為siRNA-PTEN組及對照的SsiRNA組，LPS刺激6h后雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測NF-kB轉(zhuǎn)錄活性；RAW264.7細(xì)胞分為正常細(xì)胞

11、組及PTEN抑制劑組，LPS刺激6h后雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測NF-kB轉(zhuǎn)錄活性。 5．RAW264.7細(xì)胞分為過表達(dá)野生型PTEN組及空載體組，每組再分為未刺激及LPs(1μg/ml)刺激后15、30min組，收集細(xì)胞蛋白，Western Blot法檢測Akt磷酸化水平及總蛋白含量。RAW264.7細(xì)胞分為兩組，正常細(xì)胞組及PTEN抑制劑組，每組再分為未刺激及LPS(1μg/ml)刺激后10、20、30、45、60min組，

12、收集細(xì)胞蛋白，WesternBlot法檢測Akt磷酸化水平及總蛋白含量。 6．RAW264.7細(xì)胞分為四組，過表達(dá)空載體組、過表達(dá)野生型PTEN組、過表達(dá)C124A-PTEN組、過表達(dá)G129E-PTEN組，LPS(1μg/ml)刺激6h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA法檢測TNF-α水平。 7．RAW264.7細(xì)胞分為LPS(-)組及LPS 1μg/ml刺激20min組。免疫共沉淀法檢測PTEN與TLR4交互作用。

13、 結(jié)果： 1．LPS刺激后PTEN蛋白表達(dá)在8h未發(fā)生明顯變化，24h后出現(xiàn)劑量依賴性降低，而48h時卻出現(xiàn)劑量依賴性增高。LPS刺激后PTEN磷酸化水平減低，在LPS刺激后20、30、45min降低明顯，而PTEN蛋白表達(dá)無明顯變化。提示LPS刺激后，PTEN可迅速脫磷酸而被活化； 2．與干擾RNA對照組相比，siRNA-PTEN引起的PTEN下調(diào)導(dǎo)致LPS誘導(dǎo)的TNF-α分泌減少；與正常細(xì)胞組相比，PTEN抑制劑組

14、LPS刺激后TNF-α分泌減少。表明PTEN對炎癥介質(zhì)TNF-α具有正向調(diào)控作用； 3．與空載體轉(zhuǎn)染組LPS刺激后相同時相點相比，過表達(dá)野生型PTEN組p-ERK、p-P38、p-JNK水平較弱；與正常細(xì)胞組LPS刺激后相同時相點相比，PTEN抑制劑組LPS刺激后p-ERK、p-P38、p-JNK水平增高。提示PTEN對炎癥介質(zhì)TNF-α的正向調(diào)控與MAPK關(guān)系不大； 4．與空載體轉(zhuǎn)染組相比，過表達(dá)野生型PTEN組LPS

15、誘導(dǎo)的NF-kB活性增強(qiáng)，而突變型PTEN則沒有明顯作用；與對照干擾RNA組相比siRNA-PTEN引起的PTEN下調(diào)導(dǎo)致LPS誘導(dǎo)的NF-kB活性減弱；與正常細(xì)胞組相比，PTEN抑制劑組LPS誘導(dǎo)的NF-kB活性減弱。表明PTEN可通過正向調(diào)控NF-kB的作用參與炎癥反應(yīng)； 5．與空載體轉(zhuǎn)染組相比，過表達(dá)野生型PTEN組LPS刺激后相同時相點p-Akt水平較弱；與正常細(xì)胞組相比，PTEN抑制劑組LPS刺激后相同時相點p-Akt

16、水平增高。提示PTEN對NF-kB活性的正向調(diào)控作用是通過下調(diào)Akt活性而介導(dǎo)的； 6．與空載體轉(zhuǎn)染組相比，過表達(dá)野生型PTEN可促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的TNF-α分泌，而蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶雙突變型PTEN(C124A-PTEN)，以及單純脂質(zhì)磷酸酶位點單突變型PTEN(G129E-PTEN)則沒有明顯作用。表明PTEN促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放主要與其脂質(zhì)磷酸酶的活性有關(guān)； 7．免疫共沉淀實驗顯示，未予LPS刺激時，PTEN與TL

17、R4結(jié)合，LPS刺激20min后，結(jié)合減弱。 結(jié)論： 1。LPS可影響PTEN的蛋白表達(dá)水平；LPS刺激后PTEN表達(dá)在8h不變，24h呈劑量依賴性減少，48h呈劑量依賴性增高。說明LPS在不同時期對PTEN蛋白表達(dá)的調(diào)控作用不同。LPS刺激可使PTEN脫磷酸，從而活化PTEN，使PTEN參與LPS誘導(dǎo)的TLR4活化的信號通路。 2．PTEN可能通過其脂質(zhì)磷酸酶的作用，抑制下游信號分子Akt的活性，使NF-kB的