參與LPS-TLR4-MyD88信號通路的新型介導分子的研究.pdf

1、TRAF6蛋白在LPS/TLR4介導的MyD88依賴型的信號通路中起核心的作用，目前已有報道TAK1作為TRAF6的下游底物，與TAB1/TAB2/TAB3形成復合物，進而激活NF-kB、MAPK信號通路，促進細胞炎癥因子的釋放。但是，隨后有實驗室利用最新基因敲除技術在小鼠或細胞水平敲掉TAK1、TAB1、TAB2，MEKK3等基因后，用LPS刺激誘導MyD88依賴型信號通路，發(fā)現(xiàn)對NF-kB和MAPK信號通路均沒有影響。因此，在LPS

2、誘導的LPS/TLR4/MyD88信號通路中，目前對TRAF6下游蛋白及連接NF-kB、MAPK信號通路的上游這一中間區(qū)域還有待挖掘并找到新型的介導分子。
　　利用CRISPR-CAS9技術敲除RAW264.7細胞的TRAF6基因，我們發(fā)現(xiàn)LPS誘導的MyD88依賴型的NF-kB、MAPK信號通路被抑制，這說明了TRAF6對激活NF-kB、MAPK信號通路是必不可少的;同時，在我們得到TAK1-/-、MEKK3-/-、TAK1-/

3、-MEKK3-/-細胞后，LPS誘導產生的NF-kB、MAPK信號通路的激活都不受到影響，這進一步驗證了TAK1、MEKK3蛋白在LPS/TLR4/MyD88/TRAF6信號通路中不是必需的。
　　在TRAF6-/-RAW264.7細胞里面回補帶有3*flag標簽的TRAF6質粒，得到穩(wěn)定表達細胞株，結合Western Blotting技術篩出表型與RAW264.7野生型一致的細胞株。我們通過免疫共沉淀方法，再借助質譜技術，找到了

4、兩個可能參與LPS/TLR4/MyD88/TRAF6信號通路新的介導分子，Nik和Rltpr。Nik又稱絲裂原活化蛋白激酶3K14，目前報道它主要參與促進NFKB2/P100的蛋白水解而參與非經典途徑NF-kB的激活;Rltpr蛋白，主要由富含亮氨酸重復序列，脯氨酸序列和類似原肌球調節(jié)蛋白序列構成，參與細胞骨架調節(jié)作用。我們同樣利用CRISPR-CAS9技術，分別敲除野生型RAW264.7細胞的Nik和Rltpr基因，篩選出單克隆Nik