TLR4介導(dǎo)的MyD88信號(hào)通路在PC12細(xì)胞氧糖剝奪導(dǎo)致的損傷中的作用.pdf

1、前言
　　 腦缺血再灌注損傷有著極其復(fù)雜的病理生理機(jī)制,其中涉及炎癥反應(yīng),自由基損傷,興奮性氨基酸生成,鈣超載,細(xì)胞凋亡以及神經(jīng)元代謝障礙等因素。最近大量研究表明急性炎癥反應(yīng)在缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)中起著關(guān)鍵作用,而且抑制炎癥可以有效地緩解腦缺血再灌注導(dǎo)致的損傷。
　　 TLR4作為脂多糖(革蘭氏陰性菌的細(xì)胞外壁的主要組成成分)的受體在先天免疫中所起的作用最重要。

2、除了脂多糖,其他內(nèi)源性的配體也可以激活TLR4受體,例如高速遷移族蛋白B1(high-mobility group box 1,HMGB1),熱休克蛋白60(heat-shock protein 60,HSP60)等這些從壞死細(xì)胞中或者損傷細(xì)胞中釋放的因子都可以激活TLR4激活NF-кB導(dǎo)致炎性因子TNF-α,IL-1β和IL-6的釋放。另外,TLR4在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)并不僅僅局限于膠質(zhì)細(xì)胞,最近的研究發(fā)現(xiàn)TLR4表達(dá)于皮質(zhì)神經(jīng)元中,而

3、且在葡萄糖剝奪導(dǎo)致的能量代謝障礙中,神經(jīng)元中的TLR4被激活表達(dá)量升高,使神經(jīng)元更易于遭受缺血導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。
　　 TLR4的激活導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)含有TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白例如MyD88和TRIF(TIR domain-containing adaptor protein inducing interferon-β)聚集到TLR4的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。因而TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路可以分為MyD88依賴性和MyD88非依賴性/TRIF依賴型。M

4、yD88最初是作為12個(gè)髓樣分化初次應(yīng)答基因中的成員被發(fā)現(xiàn)的,MyD88作為胞內(nèi)接頭蛋白能夠介導(dǎo)10個(gè)TLRs家族的信號(hào)傳導(dǎo)。研究表明接頭蛋白MyD88基因敲除的小鼠能在腎臟和心肌的缺血再灌注損傷中能夠大大減輕功能紊亂和組織的損傷。因此MyD88依賴性的信號(hào)通路可能參與了缺血再灌注導(dǎo)致的損傷,并在此過程中加重了器官損傷。然而在TLR4激活導(dǎo)致的肝臟的缺血再灌注損傷的研究中發(fā)現(xiàn),TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路參與缺血再灌注損傷是通過IRF-3而不

5、是通過MyD88依賴性的信號(hào)通路完成的。因此TLR4介導(dǎo)的MyD88信號(hào)通路在缺血再關(guān)準(zhǔn)損傷中的作用,還有待于進(jìn)一步研究。
　　 在本實(shí)驗(yàn)中,我們構(gòu)建體外缺血模型,將PC12細(xì)胞用于氧糖剝奪處理,研究TLR4介導(dǎo)的MyD88信號(hào)通路在該過程中的作用。應(yīng)用RNAi抑制MyD88的表達(dá),研究阻斷MyD88依賴性的信號(hào)通路后對(duì)炎癥因子TNF-α,IL-1β的表達(dá),細(xì)胞活力,以及氧糖剝奪下的細(xì)胞凋亡的影響。
　　 材料和方法

6、r>　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 (一)試劑和材料
　　 山羊抗大鼠TLR4多抗,兔抗大鼠MyD88多抗,小鼠抗大鼠β-actin單抗購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,USA)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊,山羊抗兔,兔抗小鼠等二抗均購自北京中山公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5.二苯基四氮唑溴鹽(MTT),二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO),煙

7、酸己可堿(Hoechst33342),碘化丙啶(propidium iodide,PI)等購自Sigma;RPMI1640,胎牛血清和馬血清購自Gibco(Gibco,USA)；BCA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。Polybrene,慢病毒載體和Enhanced Infection Solution購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。
　　 (二)主要儀器
　　 二氧化碳培養(yǎng)箱；超凈工作臺(tái)；電熱恒溫干燥箱；電子分析天平；恒

8、溫水浴箱；低溫冷凍離心機(jī)；ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR儀；PCR儀；紫外分光光度計(jì)；酶標(biāo)儀；通用電泳儀；轉(zhuǎn)印儀；正置熒光顯微鏡；倒置熒光顯微鏡；-80℃低溫冰箱；液氮罐；凝膠成像儀。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 (一)PC12細(xì)胞培養(yǎng)和氧糖剝奪模型的建立。
　　 (二)Western blot檢測(cè)TLR4和MyD88在氧糖剝奪各組的表達(dá)量變化。
　　 (三)PC12細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染和RNA干擾沉默MyD88。

9、
　　 (四)Reverse Transcriptase PCR檢測(cè)TLR4在PC12細(xì)胞中的表達(dá),Real-TimePCR檢測(cè)IL-1β和TNF-α mRNA的表達(dá)量變化。
　　 (五)ELISA測(cè)定IL-1β和TNF-α的蛋白表達(dá)量變化。
　　 (六)Hoechst 33342/PI雙染檢測(cè)PC12細(xì)胞的凋亡和壞死。
　　 (七)MTT檢測(cè)PC12細(xì)胞氧糖剝奪后的細(xì)胞活力。
　　 (八)數(shù)據(jù)分

10、析。Western blot和RT-PCR結(jié)果采用Gel Pro Analyzer 4.0軟件定量分析條帶的IDV。ELISA結(jié)果采用origin 6.0制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和計(jì)算樣品數(shù)值。
　　 (九)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。所有結(jié)果都表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,在SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05和P<0.01為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 討論
　　 實(shí)驗(yàn)表明在氧糖剝奪處理的PC12細(xì)胞中,TLR4和MyD88的表達(dá)量上調(diào)

11、,表明TLR4和MyD88在氧糖剝奪的PC12中被激活。而且TLR4的表達(dá)是呈時(shí)間依賴性的形式變化。同時(shí)MyD88作為TLR4的下游接頭蛋白,其表達(dá)量在氧糖剝奪3-4h之后,也有明顯的升高。與TLR4表達(dá)趨勢(shì)相同在氧糖剝奪三小時(shí),MyD88的表達(dá)量達(dá)到最高,之后開始下降,這表明在氧糖剝奪過程中對(duì)TLR4介導(dǎo)的MyD88信號(hào)通路存在調(diào)控機(jī)制。MyD88作為TLRs家族的胞內(nèi)接頭蛋白,最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF-кB的活化,最終導(dǎo)致炎癥因子IL-

12、1β,TNF-α和IL-6轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這些炎癥因子的表達(dá),使器官內(nèi)的炎癥反應(yīng)惡化,導(dǎo)致細(xì)胞損傷和凋亡。有報(bào)道稱,內(nèi)源性的TNF-α加重局灶性的缺血損傷,在腦梗塞中阻斷TNF-α能夠減輕腦缺血損傷。在我們的研究中我們發(fā)現(xiàn),氧糖剝奪處理PC12細(xì)胞,在細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β和TNF-α的水平上升,而用RNA干擾阻斷MyD88信號(hào)通路之后,經(jīng)過氧糖剝奪,PC12細(xì)胞培養(yǎng)上清的IL-1β和TNF-α表達(dá)量明顯下降。TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路在能量剝

13、奪處理的皮質(zhì)神經(jīng)元中激活,并且導(dǎo)致JNK-AP1信號(hào)通路和Caspase-3的激活,在我們的研究中發(fā)現(xiàn),RNA沉默MyD88組的細(xì)胞經(jīng)過3h氧糖剝奪之后,細(xì)胞活力明顯強(qiáng)于氧糖剝奪組和陰性病毒轉(zhuǎn)染組。并且,MyD88沉默組的凋亡細(xì)胞的數(shù)量與氧糖剝奪組和陰性病毒轉(zhuǎn)染組相比呈現(xiàn)明顯的下降。這可能是由于阻斷MyD88依賴性的信號(hào)通路之后,也阻斷了JNK-AP1的活化,并且減少了TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)。因此,TLR4介導(dǎo)的MyD88信號(hào)通路在