PTPRO對(duì)LPS-TLR4介導(dǎo)的肝損傷的調(diào)控作用.pdf

1、第一部分PTPRO/TLR4/NF-κB在肝癌中的作用
　　背景:炎癥常伴隨或促進(jìn)腫瘤發(fā)生，并在腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、逃逸及消退中發(fā)揮重要作用。炎癥反應(yīng)本身是宿主防御的重要機(jī)制，參與清除外來(lái)病原體、修復(fù)組織損傷、參與組織再生等過(guò)程。若給予適當(dāng)干預(yù)，急性炎癥并不會(huì)干擾機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡，反而能參與組織修復(fù)及重塑。然而，病原體長(zhǎng)期慢性感染能夠逃避免疫監(jiān)視、打破免疫耐受，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。原發(fā)性肝癌是世界衛(wèi)生組織公布的十大惡性腫瘤之一，近年

2、來(lái)，其發(fā)病率與死亡率均上升，致死率列全球高致死性腫瘤第三位，被稱為“癌中之王”。原發(fā)性肝癌通常發(fā)生在慢性肝損傷的基礎(chǔ)上，包括慢性肝炎、肝硬化，二者被認(rèn)為是肝臟癌前病變。長(zhǎng)期慢性肝臟炎性狀態(tài)促使肝硬化發(fā)生，并激活肝臟細(xì)胞的再生潛能，即肝臟自我修復(fù)。肝臟自我修復(fù)的短暫激活能夠迅速修復(fù)受損的肝組織，但若持續(xù)激活則可維持長(zhǎng)期的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤。臨床上，肝癌可分為肝細(xì)胞型、膽管細(xì)胞型、混合型三種，其中以肝細(xì)胞性肝癌(HCC)最為常見(jiàn)。HCC

3、的主要病因?yàn)槁曰顒?dòng)性肝炎，包括HBV和HCV導(dǎo)致的病毒性肝炎，酒精性肝炎及非酒精性脂肪肝。目前國(guó)內(nèi)常見(jiàn)的HCC以HBV感染為主要途徑。研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體4(TLR4)介導(dǎo)的固有免疫信號(hào)網(wǎng)絡(luò)在肝癌的發(fā)生、進(jìn)展中扮演重要角色，但它是促癌還是抑癌因素仍然存在爭(zhēng)議。受體O型蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPRO)是一種新型腫瘤抑制因子，它在肝癌組織中明顯下調(diào)，但對(duì)LPS/TLR4介導(dǎo)的肝損傷的調(diào)控作用，至今尚無(wú)報(bào)道。
　　目的:探討PTPR

4、O對(duì)LPS/TLR4信號(hào)活化的影響及它們?cè)诟伟┲械恼{(diào)節(jié)作用。
　　方法:(1) Real-time PCR及Westernblot法分別檢測(cè)84例HCC病人癌與癌旁組織中PTPRO與TLR4mRNA及蛋白水平的表達(dá);(2)構(gòu)建PTPRO過(guò)表達(dá)慢病毒載體，并穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞株HuH7及SNU423;(3)檢測(cè)PTPRO過(guò)表達(dá)HuH7及SNU423細(xì)胞TLR4 mRNA及蛋白水平的表達(dá);(4)檢測(cè)LPS刺激的肝癌細(xì)胞PTPRO與TLR4

5、mRNA及蛋白水平的表達(dá);同時(shí)Westernblot及激光共聚焦觀察LPS刺激對(duì)IκBα、NF-κB/P65的活化情況;(5) CCK-8法檢測(cè)LPS刺激對(duì)PTPRO過(guò)表達(dá)的HuH7細(xì)胞增殖的情況;(6)觀察Bay11-7082對(duì)LPS刺激的HuH7細(xì)胞PTPRO mRNA及蛋白水平的影響;(7)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)觀察LPS刺激對(duì)HuH7細(xì)胞PTPRO啟動(dòng)子活性的改變。
　　結(jié)果:(1) PTPRO與TLR4在HCC病人癌組

6、織中明顯低表達(dá)，Pearson相關(guān)分析提示二者呈明顯正相關(guān)關(guān)系;(2) HuH7及SNU423肝癌細(xì)胞株成功穩(wěn)定過(guò)表達(dá)PTPRO;(3) PTPRO過(guò)表達(dá)的HuH7及SNU423細(xì)胞TLR4也被明顯上調(diào);(4) LPS能夠通過(guò)活化IκBα、NF-κB/P65上調(diào)PTPRO的表達(dá)，但TLR4表達(dá)沒(méi)有明顯變化;(5) PTPRO過(guò)表達(dá)HuH7細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制;(6) Bay11-7082能夠抑制LPS對(duì)HuH7細(xì)胞PTPRO的上調(diào)作用;(7)

7、 PTPRO啟動(dòng)子突變后失去NF-κB/Rel同源結(jié)構(gòu)域的結(jié)合序列，因而，LPS不能刺激其活化。
　　結(jié)論: PTPRO與LPS/TLR4在HCC相關(guān)性炎癥中存在反饋調(diào)控，這一反饋調(diào)節(jié)作用通過(guò)NF-κB信號(hào)通路的活化來(lái)實(shí)現(xiàn)。
　　第二部分PTPRO/TLR4/NF-κB在暴發(fā)性肝炎中的作用
　　背景:暴發(fā)性肝炎又稱急性壞死性肝炎、急性肝衰竭、暴發(fā)性肝衰竭，以肝細(xì)胞大量壞死而出現(xiàn)的以肝功能嚴(yán)重受損為特征，致死率很高，主要

8、誘因有感染，過(guò)度飲酒，過(guò)量使用藥物等。肝臟缺血-再灌注損傷的肝細(xì)胞的PTPRO能夠減輕肝損傷，而在巨噬細(xì)胞中，PTPRO則加重肝損傷，這一相反作用是通過(guò)反饋調(diào)控NF-κB的活性實(shí)現(xiàn)的，提示PTPRO在不同的免疫微環(huán)境中可能具有不同的調(diào)控作用。TLR4是TLRs家族的重要分子，它是LPS的膜受體，屬于TLR家族，是一種跨膜蛋白。研究提示，TLR4及其下游信號(hào)的活化能夠促進(jìn)暴發(fā)性肝炎的發(fā)生及病程進(jìn)展。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PTPRO與TLR4

9、/NF-κB信號(hào)形成反饋調(diào)控回路，對(duì)HCC相關(guān)性炎癥具有調(diào)節(jié)作用。PTPRO及PTPRO與TLR4/NF-κB信號(hào)的相互作用對(duì)暴發(fā)性肝炎發(fā)病的影響目前少見(jiàn)報(bào)道。本章節(jié)應(yīng)用LPS/D-GaIN腹腔注射模擬巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的小鼠暴發(fā)型肝炎模型，通過(guò)觀察PTPRO對(duì)LPS介導(dǎo)的肝臟炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，探討PTPRO與TLR4/NF-κB在FH中的調(diào)控機(jī)制。
　　目的:探討PTPRO/LPS/TLR4在暴發(fā)性肝炎中的作用。
　　方法:(

10、1) LPS/D-GaIN給藥后，觀察PTPRO WT及KO小鼠的生存率;(2) LPS/D-GaIN給藥后，觀察小鼠肝臟損傷情況，包括肝酶生化檢測(cè)、HE染色及TUNEL凋亡檢測(cè);(3) Real-time PCR及ELISA法分別檢測(cè)小鼠血清及肝內(nèi)炎性因子的表達(dá);(4) FACS檢測(cè)小鼠脾臟內(nèi)F4/80+TLR4+細(xì)胞的浸潤(rùn)情況;Real-time PCR及Western-blot法檢測(cè)小鼠肝組織TLR4的表達(dá);(5) FACS觀察小

11、鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的亞型;(6) LPS/D-GaIN腹腔注射后，Western-blot檢測(cè)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞IκB-α、NF-κB/P65的磷酸化水平;免疫組化觀察p-NF-κB/P65的核轉(zhuǎn)位;(7)體外刺激培養(yǎng)RAW264.7，觀察PTPRO對(duì)LPS/TLR4介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果:(1) LPS/D-GaIN腹腔注射后，PTPRO KO小鼠較WT小鼠死亡率升高，給藥48h后，兩組小鼠均死亡;(2) LP

12、S/D-GaIN給藥后，PTPRO KO小鼠肝酶升高，肝組織較野生小鼠壞死更加明顯、肝細(xì)胞大量凋亡;(3) PTPRO KO小鼠肝內(nèi)及血清中TNF-α、IL-6 mRNA水平較空白對(duì)照組升高，但低于PTPROWT小鼠;(4) LPS/D-GaIN給藥后，PTPRO KO小鼠脾臟內(nèi)浸潤(rùn)的F4/80+TLR4+細(xì)胞明顯低于WT小鼠，PTPRO KO小鼠肝組織中TLR4的表達(dá)較空白對(duì)照組升高，但明顯低于WT小鼠;(5)PTPRO KO小鼠脾臟

13、內(nèi)CD3+IFN-γ+、CD3+TNF-α+細(xì)胞均較WT小鼠明顯減少;(6) PTPRO KO小鼠脾臟淋巴細(xì)胞p-IκB-α及p-NF-κB/P65較WT小鼠明顯下調(diào);PTPRO KO小鼠肝組織中p-NF-κB/P65核轉(zhuǎn)位低于WT小鼠，Bay11-7082則能抑制LPS/D-GaIN對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的活化;(7) PTPRO能夠調(diào)控LPS/TLR4介導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)，PTPRO與TLR4的反饋調(diào)控依賴NF-κB信號(hào)途徑。