miRNA-26a經(jīng)由USP3介導(dǎo)對肝癌細胞增殖的調(diào)控作用.pdf

1、目的:探討經(jīng)由USP3介導(dǎo),miR-26a對小鼠正常肝細胞和肝癌細胞增殖過程的差異調(diào)控,闡明miR-26a通過其靶基因USP3抑制肝癌細胞增殖的分子機制,為USP3作為肝癌細胞基因治療靶點提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.實時熒光定量 PCR技術(shù)檢測小鼠正常肝細胞(BNL CL.2)和肝癌細胞(Hepa1-6)miR-26a和 USP3的表達水平,以及臨床肝癌和癌旁組織病例標(biāo)本中miR-26a和USP3的表達水平。

2、　　2.雙熒光素酶活性實驗驗證USP3是miR-26a的直接靶基因。
　　3.小鼠正常肝細胞和肝癌細胞轉(zhuǎn)染miR-26a模擬物以及抑制USP3的慢病毒后,用CCK8比色測定法和3H-TdR同位素摻入法檢測小鼠正常肝細胞和肝癌細胞的增殖情況。
　　4. Western blot法檢測USP3以及PCNA,MDM2,Cdc25C,Chk1等相關(guān)蛋白的表達。
　　結(jié)果:
　　1.實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-26a

3、表達水平在小鼠正常肝細胞中比肝癌細胞高,USP3表達水平與miR-26a趨勢相反。
　　2.通過生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測,發(fā)現(xiàn)miR-26a在USP3-3'UTR有一段7個堿基完全互補配對。為了驗證USP3是miR-26a的直接靶基因,我們構(gòu)建了含USP3-3'UTR野生型及突變型的報告基因質(zhì)粒,通過雙熒光素酶活性實驗發(fā)現(xiàn),miR-26a可顯著抑制USP3-3'UTR野生型報告基因質(zhì)粒的熒光素酶活性而對突變型無顯著影

4、響。
　　3.對小鼠正常肝細胞BNL CL.2和肝癌細胞Hepa1-6分別轉(zhuǎn)染miR-26a模擬物(miR-26a mimics)和抑制USP3的慢病毒(LV-shUSP3)后,小鼠正常肝細胞和肝癌細胞的增殖均受到抑制,但對小鼠肝癌細胞的抑制增殖作用更為明顯。
　　4.Western blot方法檢測結(jié)果顯示,小鼠正常肝細胞BNL CL.2在轉(zhuǎn)染miR-26a mimics或LV-shUSP3后,USP3和MDM2蛋白表達量

5、明顯降低,PCNA蛋白表達量增加,Cdc25C,Chk1蛋白表達量無明顯變化;小鼠肝癌細胞Hepa1-6在轉(zhuǎn)染miR-26a mimics或LV-shUSP3后,USP3和MDM2蛋白表達量明顯降低,PCNA,Cdc25C,Chk1蛋白表達量無明顯變化。
　　結(jié)論:
　　1.USP3是miR-26a的直接靶基因。
　　2.miR-26a通過靶向調(diào)節(jié)USP3抑制小鼠正常肝細胞和肝癌細胞的增殖,并且對肝癌細胞的抑制作用更為