MiRNA-26a對大鼠心臟重構的調(diào)控作用.pdf

1、背景：
　　心臟重構在近年來被國內(nèi)外研究者認為是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的根本原因之一，心臟重構是由包括心臟成纖維細胞、心肌細胞和細胞外基質(zhì)共同參與、通過一系列復雜的分子途徑和細胞激活所誘導的動態(tài)發(fā)展過程。心臟重構的病理形態(tài)主要表現(xiàn)為心肌細胞肥大、心肌間質(zhì)纖維化和心肌細胞凋亡，其中心肌間質(zhì)纖維化可以通過限制心肌細胞活動，增加心肌僵硬度，從而降低心室順應性，影響心肌的收縮和舒張功能。微小RNA(miRNA)是一類長度約19-23個堿基的單鏈

2、非編碼 RNA分子，通過與靶基因的結合，抑制或降解靶基因的mRNA，實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平的負調(diào)控。大量研究證實miR-26a在心臟重構動物模型心肌組織中的表達下調(diào)，結合生物信息學軟件分析，TGF-β-smads相關通路很可能是miR-26a的靶目標之一，而TGF-β-smads相關通路是心臟重構、心衰發(fā)病過程中的重要信號轉(zhuǎn)導通路，miR-26a可能會通過調(diào)控TGF-β-smads相關通路的表達，進而影響心臟重構。為此，我們通過建立心臟重構大鼠

3、動物模型和細胞模型，研究miRNA-26a對TGF-β-smads蛋白及其相關通路和膠原代謝的調(diào)控作用，以明確在心衰、心臟間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用蛋白的表達，從而基于該蛋白設計其特異性的miRNA的分子藥物以調(diào)控該特異蛋白的表達，從而在心臟重塑過程中對膠原的代謝起調(diào)控作用，miRNA及其下游特異性的靶蛋白和膠原代謝相關性的研究將為心肌重塑提供新的研究方向，建立起全新的針對心衰的治療靶點，對于心血管疾病治療的臨床應用具有重大的指

4、導意義。
　　一、研究目的：
　　1.探索 miR-26a在大鼠心臟重構動物模型和細胞模型中的可能角色；
　　2.通過細胞實驗，了解 miR-26a、TGF-β-smads相關通路蛋白和心臟重構三者之間的關系。
　　二、研究內(nèi)容：
　　1.手術制備大鼠心臟肥厚模型并心臟超聲檢測心臟結構和功能，以驗證動物模型；
　　2.采用QRT-PCR(Real time Quantitative PCR實時熒光定量

5、PCR)連續(xù)檢測大鼠動物模型制備過程中血漿miRNA-26a的表達變化；
　　3.細胞水平研究miRNA-26a對RCF(Rat Cardiac Fibroblasts大鼠心臟成纖維細胞)膠原合成的影響，并驗證其可能作用位點TGF-β、Smads相應mRNA及蛋白表達水平的變化。
　　三、研究方法：
　　1.腹主動脈縮窄法建立大鼠壓力過負荷心臟重構模型，用動物心臟彩超、病理組織切片染色等方法證實壓力過負荷心臟重構模型建

6、立成功。
　　2. QRT-PCR法連續(xù)檢測TAAC（Transverse Abdominal Aortic Constrition腹主動脈縮窄術）組及Sham（假手術）組大鼠血漿 miR-26a的表達水平。
　　3.RCF轉(zhuǎn)染 miR-26a mimics（擬似物）和inhibitor（抑制劑）及其各自NC(陰性對照)后，研究miRNA-26a通過靶向TGF-β、smads蛋白通路調(diào)節(jié)膠原合成的功能。QRT-PCR法檢測各

7、組miR-26a的表達水平；Western blot檢測I型、III型膠原蛋白量的變化，QRT-PCR檢測各組間I型、III型膠原蛋白mRNA水平的變化；并Western blot方法檢測TGF-β及smads通路相關蛋白的變化（TGF-β1、smad4、smad7），QRT-PCR檢測各組TGF-β及smads通路蛋白的mRNA的改變（TGF-β1、smad4、smad7）。
　　四、結果：
　　1.用 TAAC法成功建立

8、大鼠壓力過負荷心臟重構模型；
　　2.TAAC心臟重構大鼠血漿中 miR-26a的水平與對照組（Sham）相比，第二周開始下調(diào)，第三周達到高峰，之后處于穩(wěn)定水平但較對照組及術前仍有所下降（P﹤0.01）；
　　3.RCF轉(zhuǎn)染 miR-26a mimics后，miR-26a表達量較其陰性對照組明顯升高（P﹤0.01）；轉(zhuǎn)染 miR-26a inhibitor后，miR-26a的表達量較其陰性對照組明顯下降（P﹤0.01）；

9、r>　　4.RCF轉(zhuǎn)染 miR-26a mimics后，TGF-β1、smad4 mRNA的表達量減少（P﹤0.01），TGF-β1、smad4的蛋白表達量減少（P﹤0.01），而轉(zhuǎn)染 miR-26a inhibitor后，TGF-β1、smad4 mRNA的表達量增多（P﹤0.01），TGF-β1、smad4的蛋白表達量增多（P﹤0.01）；而smad7 mRNA及蛋白水平表達均未見明顯差異（P>0.05）。
　　5.RCF轉(zhuǎn)染

10、 miR-26a mimics后，I型、III型膠原mRNA及蛋白表達增加（P﹤0.01），而轉(zhuǎn)染 miR-26a inhibitor后，I型、III型膠原mRNA及蛋白表達減少（P﹤0.01）。
　　五、結論：
　　1. miR-26a在大鼠心臟重構模型中表達下調(diào)且發(fā)生在心臟重構之前，對于臨床心衰或心肌重構可能具有早期診斷意義。
　　2. miR-26a可能通過作用于靶點TGF-β-smads相關通路蛋白調(diào)控心臟重構