miRNA對骨質(zhì)疏松癥BMMSCs免疫調(diào)節(jié)功能的調(diào)控作用.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)以骨結(jié)構(gòu)破壞為主要特征的一類受免疫調(diào)控的慢性炎性骨疾病，是造成機(jī)體骨量喪失的最主要的原因之一。在口腔治療領(lǐng)域，為種植、修復(fù)義齒和頜面外科手術(shù)治療帶來很大困難。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)因具有免疫調(diào)節(jié)功能和多向分化潛能而受到廣泛關(guān)注。目前，關(guān)于骨質(zhì)疏松癥影響MSCs生物學(xué)特性的研究較為局限，多集中于MSCs分化能力的異常，對于其免疫調(diào)節(jié)功能是否存在改變

2、則研究較少。最近研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs(miRNAs)以其特有的靶向結(jié)合目的mRNAs特點可調(diào)控MSCs多向分化能力，從而在骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展和治療中發(fā)揮了重要作用。然而，在骨質(zhì)疏松癥病理狀態(tài)下是否存在miRNAs調(diào)控MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能則缺乏相關(guān)研究。
　　研究目的：
　　旨在探析骨質(zhì)疏松癥個體MSCs免疫調(diào)節(jié)能力是否存在異常及其作用途徑，并進(jìn)一步探討該途徑是否存在miRNA的調(diào)控，并確定抑制何種miRNA能逆轉(zhuǎn)其

3、免疫調(diào)節(jié)能力的減弱，以加深對骨質(zhì)疏松癥和MSCs免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的了解，為臨床上治療疾病提供新的思路和方法。
　　研究方法：
　　1.雌性8周齡C57BL/6J小鼠構(gòu)建OVX與sham模型。4周后Micro-CT檢測模型構(gòu)建成功。骨髓培養(yǎng)OVXBMMSCs(O/BMMSCs)與shamBMMSCs(S/BMMSCs)。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原標(biāo)記。給予O/BMMSCs與S/BMMSCs特定的誘導(dǎo)刺激環(huán)境，鑒定兩組BMMSCs多

4、向分化潛能。
　　2.雌性8周齡體重相近的C57BL/6J小鼠構(gòu)建炎癥性腸炎模型，尾靜脈注射O/BMMSCs與S/BMMSCs治療分析兩組療效差異。O/BMMSCs與S/BMMSCs與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測兩組細(xì)胞對T淋巴細(xì)胞凋亡、趨化遷移能力的影響，Elisa檢測兩組BMMSCs分泌趨化因子MCP-1的表達(dá)。
　　3.檢測與O/BMMSCs及S/BMMSCs免疫調(diào)控能力相關(guān)的Fas及FasL基因表達(dá)差異。miRNA數(shù)據(jù)庫分

5、析篩選出可能調(diào)控Fas及FasL基因的miRNA。實時定量PCR、Western Blot和構(gòu)建熒光素酶報告載體等方法，進(jìn)行該miRNA調(diào)控Fas及FasL的靶基因驗證。
　　4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)抑制O/BMMSCs中Let-7a的表達(dá)，采用尾靜脈注射BMMSCs治療炎癥性腸炎小鼠，轉(zhuǎn)染后BMMSCs與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，分析抑制Let-7a表達(dá)對O/BMMSCs異常免疫調(diào)控能力的逆轉(zhuǎn)作用。
　　研究結(jié)果：
　　1.構(gòu)建完成

6、4周的OVX與sham小鼠動物模型，OVX組小鼠股骨干骺端骨小梁數(shù)量、骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)與sham組相比明顯降低，骨小梁間隙明顯增大。O/BMMSCs與S/BMMSCs均正常表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志。誘導(dǎo)一定時間后兩組細(xì)胞均具有成骨和成脂分化潛能。O/BMMSCs成骨能力弱于S/BMMSCs，而成脂能力強(qiáng)于S/BMMSCs。
　　2.O/BMMSCs較S/BMMSCs治療小鼠炎癥性腸炎效果欠佳。O/BMMSCs共培養(yǎng)組T淋巴細(xì)胞凋

7、亡和趨化遷移及分泌趨化因子MCP-1能力均弱于S/BMMSCs組。
　　3.O/BMMSCs與S/BMMSCs相比Fas及FasL在基因水平上表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異，而在蛋白水平上O/BMMSCs相關(guān)基因表達(dá)低于S/BMMSCs。Fas、FasL mRNA的3'非編碼區(qū)存在Let-7a的結(jié)合位點。O/BMMSCs的Let-7a表達(dá)水平高于S/BMMSCs。檢測證實，F(xiàn)as及FasL是Let-7a的靶基因，受Let-7a的調(diào)控。
　

8、　4.在O/BMMSCs中抑制Let-7a的表達(dá)能提升O/BMMSCs分泌趨化因子MCP-1的能力，進(jìn)而促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的趨化遷移和凋亡，最終改善炎癥性腸炎的治療效果。
　　研究結(jié)論：
　　O/BMMSCs通過Fas/FasL途徑介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡以下調(diào)免疫調(diào)節(jié)能力，影響其對炎癥性腸炎的療效，F(xiàn)as/FasL途徑受miRNA調(diào)控，該miRNA為Let-7a，通過Let-7a抑制作用調(diào)控T淋巴細(xì)胞遷移趨化和凋亡，影響O/BMMS