miRNA對PAN腎病大鼠nephrin介導蛋白尿調控機制及雷公藤制劑的保護作用.pdf

1、研究背景與目的:
　　 蛋白尿是慢性腎臟病進展的獨立危險因素,足細胞損傷是發(fā)生蛋白尿的關鍵環(huán)節(jié),足細胞損傷與慢性腎臟病進展密切相關。一些miRNA可能通過介導nephrin磷酸化調節(jié)足細胞裂隙膜(slitdiaphragm,SD)分子的表達,故調控miRNA可以通過改善SD蛋白的表達從而減少尿蛋白。雷公藤多苷可改善SD蛋白表達,保護足細胞,減少蛋白尿,但其分子機制未完全闡明,假設雷公藤制劑可能是通過miRNA介導nephrin磷

2、酸化實現的。本研究以雷公藤制劑治療尿蛋白的療效為臨床依據,以足細胞SD分子表達為研究靶點,以miRNA為調控因子,闡明miRNA調控SD分子表達的規(guī)律,通過雷公藤制劑對PAN誘導的足細胞損傷的形態(tài)學改變、腎組織miRNA及足細胞SD分子nephrin、podocin核酸和蛋白表達變化的干預作用,闡明雷公藤制劑治療尿蛋白的分子靶點,為延緩慢性腎臟病進展提供實驗依據。
　　 方法:
　　 芯片檢測及機制研究實驗分為5組:空白

3、組、模型組、雷至膠囊(二至丸+雷公藤多苷)高劑量組、雷公藤多苷高劑量組,在前面實驗基礎上,雷公藤制劑干預實驗分為8組:空白組、模型組、雷至膠囊高劑量組、雷至膠囊低劑量組、雷公藤多苷高劑量組、雷公藤多苷低劑量組、雷公藤甲素組和纈沙坦組,每組10只。頸靜脈注射嘌呤霉素氨基核苷(PAN)100mg/kg體重建立PAN腎病模型?？瞻捉M頸靜脈注射等量生理鹽水。各組大鼠造模后第2天開始每日固定時間分別進行灌胃給藥,持續(xù)10天.分別于造模前、造模第3

4、d、9d代謝籠喂養(yǎng),觀察大鼠一般情況、稱重、記24h尿量。造模前1d及造模10d尾靜脈抽血化驗血常規(guī)、血生化,在注射PAN后第10天,局麻下摘取肝腎,左腎分別于0.4％福爾馬林及戊二醛固定,用于光鏡、免疫熒光、TUNEL染色及透射電鏡;右腎-70冰箱儲存,用于提取腎小球總RNA、用于RT-PCR、miRNA芯片檢測及real-timeRTPCR驗證。RTPCR檢測大鼠腎組織dicer、nephrin、podocin、synaptopod

5、inmRNA表達,樣品總RNA提取后,經miRNA標記、芯片雜交、圖像掃描、數據分析,篩選表達差異明顯的miRNA,經real-timeRTPCT驗證的候選miRNA,WesternBlotting檢測dicer、nephrin、podocin、synaptopodin蛋白表達。
　　 結果:
　　 1.大鼠一般情況:PAN造模后第3d大鼠出現尿量減少、腹水,而浮腫不明顯,精神萎靡,進食減少,毛發(fā)豎起,體重下降。第5-7

6、天腹水明顯增加,表現腎病綜合癥。死亡率30％(3/10)。而空白組無腹水,尿蛋白正常,提示PAN造模成功。
　　 2.病理改變,PAN模型鼠腎小管上皮細胞變性,嚴重區(qū)域細胞壞死。所有大鼠腎小管管腔內均有透明管型,皮質部管腔輕度擴張。光鏡下腎小球及間質無明顯病變。電鏡下可見足細胞足突融合、消失,而正常對照組足細胞結構正常。
　　 3.miRNA芯片分析:經紫外分光光度法及凝膠電泳檢測證實樣品總RNA符合要求。各組芯片信號強

7、度相關分析顯示:模型組和空白組相關系數0.599,雷至膠囊組和模型組相關系數0.614.兩組信號值差異明顯,而雷至膠囊組與空白組相關系數0.932.各組內差異不明顯。
　　 芯片篩選顯示,模型組高表達miRNA106個,低表達miRNA63個,差異倍數(foldchange)在1.8～7.0。雷至膠囊高劑量組高表達的miRNA82個,低表達44個,其中,rno-mir-23a、mo-mir-300-3p等在模型模型組腎皮質高表達

8、的65個miRNA,與雷公藤制劑組相比表達下調,mo-mir-24、mo-mir-30c、mo-mir-22等模型模型組低表達的miRNA,與雷公藤制劑組腎皮質表達上調。
　　 Real-timeRTPCR結果顯示mo-mir-23a、mo-miR-300-3p在模型組高表達,表達量是空白組的2.472、2.514倍。Mo-miR-24、mo-miR-30c在模型組低表達,表達量是空白組的0.312、0.555倍。與芯片結果接近

9、,證實芯片結果可靠?？烧J為以上miRNA是PAN腎病特異性miRNA.
　　 4.與空白組比較,模型組腎組織dicer酶免疫熒光增強,diem核酸與蛋白表達均升高,而SD分子nephrin、podocin免疫熒光減弱,核酸與蛋白表達下降,相關分析表明二者呈現負相關,提示dicer通過miRNA負向調控SD分子的表達。另外,模型組足細胞骨架蛋白synaptopodin表達亦下降,TUNEL染色顯示足細胞凋亡數量增加,凋亡細胞指數明

10、顯升高(p＜0.01),提示miRNA與足細胞骨架蛋白表達減少及足細胞凋亡增加密切相關。
　　 5.與模型組比較,雷公藤制劑(雷至膠囊、雷公藤多苷不同劑量)干預后,腎組織dicer酶免疫熒光減弱,dicer核酸與蛋白表達下降,而SD分子nephrin、podocin免疫熒光改善,核酸與蛋白表達增加,提示雷公藤制劑對PAN腎病SD分子表達的調控與dicer酶有關,雷公藤制劑可通過dicer-miRNA改善SD分子的表達減少蛋白尿。

11、足細胞骨架蛋白synaptopodin表達改善,TUNEL染色顯示足細胞凋亡數量減少,說明雷公藤制劑還通過調控足細胞骨架蛋白及細胞凋亡發(fā)揮保護足細胞作用,這一作用與雷公藤制劑調控dicer與miRNA有關。
　　 6.雷公藤制劑各組24h尿蛋白、血總蛋白、白蛋白、血脂、血紅蛋白均有不同程度改善,雷至膠囊高劑量組降蛋白尿、改善貧血、降低AST療效優(yōu)于雷公藤多苷及其余對照組,各治療組血肌酐、尿素氮輕度升高(P＜0.05)。模型組腎組

12、織病理主要表現為:腎小管上皮細胞變性,嚴重區(qū)域細胞壞死。所有大鼠腎小管管腔內均有透明管型,皮質部管腔輕度擴張。腎小球及間質無明顯病變。電鏡下可見足突融合、消失,藥物有減輕腎小管上皮細胞變性,減少腎小管內透明管型的作用,其中雷至膠囊高劑量和雷公藤多苷高劑量的減輕作用與模型組相比有統(tǒng)計學顯著性差異。電鏡下雷至膠囊高劑量組足突融合減輕,足突明顯恢復。
　　 結論:
　　 1.一次性頸靜脈注射PAN100mg/kg體重可成功建立

13、典型的急性足細胞損傷模型,效果確切。
　　 2.miRNA芯片篩選顯示,PAN腎病腎皮質表達顯著上調的miRNA106個,表達下調的m/RNA62個,高表達的miRNA基因位點呈簇狀分布(clustering),集中分布于19號染色體和6號染色體,提示這2個染色體基因位點可能與PAN腎病的發(fā)生密切相關。篩選出PAN腎病特征性miRNA:mo-miR-23a、mo-miR-300-3p在PAN腎病中高表達,提示這些miRNA可能參

14、與PAN腎病足細胞損傷及蛋白尿。Mo-miR-24、mo-miR-30c在PAN腎病中低表達,提示這些miRNA可能通過抗凋亡發(fā)揮保護作用。
　　 3.dicer通過miRNA負向調控PAN腎病大鼠SD分子(nephron、podocin等)及骨架蛋白的表達,還可能通過miRNA參與足細胞凋亡的調控。提示dicer及miRNA可能是調控SD分子及蛋白尿的關鍵靶點。
　　 4.雷公藤制劑可下調PAN腎病大鼠dicer表達,

15、通過dicer-miRNA途徑改善PAN腎病大鼠SD分子nephrin、podocin及骨架蛋白synaptopodin的表達,并能通過miRNA抑制足細胞凋亡發(fā)揮保護足細胞作用。提示dicer、mo-miR-24、mo-miR-30c、mo-miR-23a可能是雷公藤制劑治療PAN腎病蛋白尿的分子治療靶點。
　　 5.本研究將二至丸聯合雷公藤多苷組成的雷至膠囊用于雷公藤減毒研究,國內外未見報道,雷至膠囊(二至丸+雷公藤多苷)降