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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景與目的:
蛋白尿是慢性腎臟病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,足細(xì)胞損傷是發(fā)生蛋白尿的關(guān)鍵環(huán)節(jié),足細(xì)胞損傷與慢性腎臟病進(jìn)展密切相關(guān)。一些miRNA可能通過(guò)介導(dǎo)nephrin磷酸化調(diào)節(jié)足細(xì)胞裂隙膜(slitdiaphragm,SD)分子的表達(dá),故調(diào)控miRNA可以通過(guò)改善SD蛋白的表達(dá)從而減少尿蛋白。雷公藤多苷可改善SD蛋白表達(dá),保護(hù)足細(xì)胞,減少蛋白尿,但其分子機(jī)制未完全闡明,假設(shè)雷公藤制劑可能是通過(guò)miRNA介導(dǎo)nephrin磷
2、酸化實(shí)現(xiàn)的。本研究以雷公藤制劑治療尿蛋白的療效為臨床依據(jù),以足細(xì)胞SD分子表達(dá)為研究靶點(diǎn),以miRNA為調(diào)控因子,闡明miRNA調(diào)控SD分子表達(dá)的規(guī)律,通過(guò)雷公藤制劑對(duì)PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的形態(tài)學(xué)改變、腎組織miRNA及足細(xì)胞SD分子nephrin、podocin核酸和蛋白表達(dá)變化的干預(yù)作用,闡明雷公藤制劑治療尿蛋白的分子靶點(diǎn),為延緩慢性腎臟病進(jìn)展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:
芯片檢測(cè)及機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)分為5組:空白
3、組、模型組、雷至膠囊(二至丸+雷公藤多苷)高劑量組、雷公藤多苷高劑量組,在前面實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,雷公藤制劑干預(yù)實(shí)驗(yàn)分為8組:空白組、模型組、雷至膠囊高劑量組、雷至膠囊低劑量組、雷公藤多苷高劑量組、雷公藤多苷低劑量組、雷公藤甲素組和纈沙坦組,每組10只。頸靜脈注射嘌呤霉素氨基核苷(PAN)100mg/kg體重建立PAN腎病模型??瞻捉M頸靜脈注射等量生理鹽水。各組大鼠造模后第2天開(kāi)始每日固定時(shí)間分別進(jìn)行灌胃給藥,持續(xù)10天.分別于造模前、造模第3
4、d、9d代謝籠喂養(yǎng),觀(guān)察大鼠一般情況、稱(chēng)重、記24h尿量。造模前1d及造模10d尾靜脈抽血化驗(yàn)血常規(guī)、血生化,在注射PAN后第10天,局麻下摘取肝腎,左腎分別于0.4%福爾馬林及戊二醛固定,用于光鏡、免疫熒光、TUNEL染色及透射電鏡;右腎-70冰箱儲(chǔ)存,用于提取腎小球總RNA、用于RT-PCR、miRNA芯片檢測(cè)及real-timeRTPCR驗(yàn)證。RTPCR檢測(cè)大鼠腎組織dicer、nephrin、podocin、synaptopod
5、inmRNA表達(dá),樣品總RNA提取后,經(jīng)miRNA標(biāo)記、芯片雜交、圖像掃描、數(shù)據(jù)分析,篩選表達(dá)差異明顯的miRNA,經(jīng)real-timeRTPCT驗(yàn)證的候選miRNA,WesternBlotting檢測(cè)dicer、nephrin、podocin、synaptopodin蛋白表達(dá)。
結(jié)果:
1.大鼠一般情況:PAN造模后第3d大鼠出現(xiàn)尿量減少、腹水,而浮腫不明顯,精神萎靡,進(jìn)食減少,毛發(fā)豎起,體重下降。第5-7
6、天腹水明顯增加,表現(xiàn)腎病綜合癥。死亡率30%(3/10)。而空白組無(wú)腹水,尿蛋白正常,提示PAN造模成功。
2.病理改變,PAN模型鼠腎小管上皮細(xì)胞變性,嚴(yán)重區(qū)域細(xì)胞壞死。所有大鼠腎小管管腔內(nèi)均有透明管型,皮質(zhì)部管腔輕度擴(kuò)張。光鏡下腎小球及間質(zhì)無(wú)明顯病變。電鏡下可見(jiàn)足細(xì)胞足突融合、消失,而正常對(duì)照組足細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。
3.miRNA芯片分析:經(jīng)紫外分光光度法及凝膠電泳檢測(cè)證實(shí)樣品總RNA符合要求。各組芯片信號(hào)強(qiáng)
7、度相關(guān)分析顯示:模型組和空白組相關(guān)系數(shù)0.599,雷至膠囊組和模型組相關(guān)系數(shù)0.614.兩組信號(hào)值差異明顯,而雷至膠囊組與空白組相關(guān)系數(shù)0.932.各組內(nèi)差異不明顯。
芯片篩選顯示,模型組高表達(dá)miRNA106個(gè),低表達(dá)miRNA63個(gè),差異倍數(shù)(foldchange)在1.8~7.0。雷至膠囊高劑量組高表達(dá)的miRNA82個(gè),低表達(dá)44個(gè),其中,rno-mir-23a、mo-mir-300-3p等在模型模型組腎皮質(zhì)高表達(dá)
8、的65個(gè)miRNA,與雷公藤制劑組相比表達(dá)下調(diào),mo-mir-24、mo-mir-30c、mo-mir-22等模型模型組低表達(dá)的miRNA,與雷公藤制劑組腎皮質(zhì)表達(dá)上調(diào)。
Real-timeRTPCR結(jié)果顯示mo-mir-23a、mo-miR-300-3p在模型組高表達(dá),表達(dá)量是空白組的2.472、2.514倍。Mo-miR-24、mo-miR-30c在模型組低表達(dá),表達(dá)量是空白組的0.312、0.555倍。與芯片結(jié)果接近
9、,證實(shí)芯片結(jié)果可靠。可認(rèn)為以上miRNA是PAN腎病特異性miRNA.
4.與空白組比較,模型組腎組織dicer酶免疫熒光增強(qiáng),diem核酸與蛋白表達(dá)均升高,而SD分子nephrin、podocin免疫熒光減弱,核酸與蛋白表達(dá)下降,相關(guān)分析表明二者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),提示dicer通過(guò)miRNA負(fù)向調(diào)控SD分子的表達(dá)。另外,模型組足細(xì)胞骨架蛋白synaptopodin表達(dá)亦下降,TUNEL染色顯示足細(xì)胞凋亡數(shù)量增加,凋亡細(xì)胞指數(shù)明
10、顯升高(p<0.01),提示miRNA與足細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)減少及足細(xì)胞凋亡增加密切相關(guān)。
5.與模型組比較,雷公藤制劑(雷至膠囊、雷公藤多苷不同劑量)干預(yù)后,腎組織dicer酶免疫熒光減弱,dicer核酸與蛋白表達(dá)下降,而SD分子nephrin、podocin免疫熒光改善,核酸與蛋白表達(dá)增加,提示雷公藤制劑對(duì)PAN腎病SD分子表達(dá)的調(diào)控與dicer酶有關(guān),雷公藤制劑可通過(guò)dicer-miRNA改善SD分子的表達(dá)減少蛋白尿。
11、足細(xì)胞骨架蛋白synaptopodin表達(dá)改善,TUNEL染色顯示足細(xì)胞凋亡數(shù)量減少,說(shuō)明雷公藤制劑還通過(guò)調(diào)控足細(xì)胞骨架蛋白及細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)足細(xì)胞作用,這一作用與雷公藤制劑調(diào)控dicer與miRNA有關(guān)。
6.雷公藤制劑各組24h尿蛋白、血總蛋白、白蛋白、血脂、血紅蛋白均有不同程度改善,雷至膠囊高劑量組降蛋白尿、改善貧血、降低AST療效優(yōu)于雷公藤多苷及其余對(duì)照組,各治療組血肌酐、尿素氮輕度升高(P<0.05)。模型組腎組
12、織病理主要表現(xiàn)為:腎小管上皮細(xì)胞變性,嚴(yán)重區(qū)域細(xì)胞壞死。所有大鼠腎小管管腔內(nèi)均有透明管型,皮質(zhì)部管腔輕度擴(kuò)張。腎小球及間質(zhì)無(wú)明顯病變。電鏡下可見(jiàn)足突融合、消失,藥物有減輕腎小管上皮細(xì)胞變性,減少腎小管內(nèi)透明管型的作用,其中雷至膠囊高劑量和雷公藤多苷高劑量的減輕作用與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。電鏡下雷至膠囊高劑量組足突融合減輕,足突明顯恢復(fù)。
結(jié)論:
1.一次性頸靜脈注射PAN100mg/kg體重可成功建立
13、典型的急性足細(xì)胞損傷模型,效果確切。
2.miRNA芯片篩選顯示,PAN腎病腎皮質(zhì)表達(dá)顯著上調(diào)的miRNA106個(gè),表達(dá)下調(diào)的m/RNA62個(gè),高表達(dá)的miRNA基因位點(diǎn)呈簇狀分布(clustering),集中分布于19號(hào)染色體和6號(hào)染色體,提示這2個(gè)染色體基因位點(diǎn)可能與PAN腎病的發(fā)生密切相關(guān)。篩選出PAN腎病特征性miRNA:mo-miR-23a、mo-miR-300-3p在PAN腎病中高表達(dá),提示這些miRNA可能參
14、與PAN腎病足細(xì)胞損傷及蛋白尿。Mo-miR-24、mo-miR-30c在PAN腎病中低表達(dá),提示這些miRNA可能通過(guò)抗凋亡發(fā)揮保護(hù)作用。
3.dicer通過(guò)miRNA負(fù)向調(diào)控PAN腎病大鼠SD分子(nephron、podocin等)及骨架蛋白的表達(dá),還可能通過(guò)miRNA參與足細(xì)胞凋亡的調(diào)控。提示dicer及miRNA可能是調(diào)控SD分子及蛋白尿的關(guān)鍵靶點(diǎn)。
4.雷公藤制劑可下調(diào)PAN腎病大鼠dicer表達(dá),
15、通過(guò)dicer-miRNA途徑改善PAN腎病大鼠SD分子nephrin、podocin及骨架蛋白synaptopodin的表達(dá),并能通過(guò)miRNA抑制足細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)足細(xì)胞作用。提示dicer、mo-miR-24、mo-miR-30c、mo-miR-23a可能是雷公藤制劑治療PAN腎病蛋白尿的分子治療靶點(diǎn)。
5.本研究將二至丸聯(lián)合雷公藤多苷組成的雷至膠囊用于雷公藤減毒研究,國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道,雷至膠囊(二至丸+雷公藤多苷)降
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