p84介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞TFF3-Twist通路調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　TFF3(Trefoil Factor Family3)又稱腸三葉因子(ITF)，是三葉肽家族的成員之一。其分子結(jié)構(gòu)中含有6個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，經(jīng)由3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵連接，形成三葉狀特征結(jié)構(gòu)域。TFF3在胃腸粘膜的損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，近幾年研究發(fā)現(xiàn):TFF3血清中的含量具有作為臨床腫瘤進(jìn)展（如胃癌、肺癌等）及患者預(yù)后評(píng)估生物學(xué)標(biāo)志物的轉(zhuǎn)化潛能。盡管研究報(bào)道TFF3異常高表達(dá)與胃腸腫瘤，食管癌，乳腺癌等腫瘤發(fā)

2、生發(fā)展相關(guān)，但TFF3參與調(diào)節(jié)結(jié)腸癌生物學(xué)行為的分子機(jī)制尚無報(bào)道。
　　我們課題組多年來一直致力于探索TFFs在粘膜穩(wěn)態(tài)調(diào)控過程的作用機(jī)制及其功能，小組前期研究報(bào)道:在IEC中，TFF3上調(diào)Twist表達(dá)從而發(fā)揮其不同于經(jīng)典炎癥信號(hào)通路（如:TNF-α）對(duì)于IL-8的穩(wěn)態(tài)調(diào)控作用。Twist作為堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)家族成員之一，除了作為細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal-Transitio

3、n，EMT)關(guān)鍵調(diào)控因子介導(dǎo)乳腺癌、前列腺癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞EMT現(xiàn)象外，還參與血管發(fā)生及染色體不穩(wěn)定過程等信號(hào)調(diào)控過程。在結(jié)腸腫瘤細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)并報(bào)告的TFF3-Twist信號(hào)通路受到國(guó)際同行的高度關(guān)注，這一新的信號(hào)軸的發(fā)現(xiàn)被認(rèn)定為重要的基于Twist靶向腫瘤的新傳導(dǎo)通路之一。近期，我們報(bào)道了Twist介導(dǎo)TFF3調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)分子機(jī)制，但在結(jié)腸腫瘤細(xì)胞中TFF3-Twist信號(hào)通路是否調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，其精細(xì)的上游分子調(diào)控機(jī)制及

4、其參與的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為尚不清楚，將作為本課題的主要研究?jī)?nèi)容。
　　本研究以結(jié)腸癌細(xì)胞系及人源標(biāo)本為研究對(duì)象，嘗試確認(rèn)TFF3上調(diào)Twist表達(dá)的上游關(guān)鍵分子調(diào)控機(jī)制，解析TFF3-Twist信號(hào)通路調(diào)節(jié)結(jié)腸腫瘤細(xì)胞EMT相關(guān)遷移的機(jī)制及臨床意義。旨在探索結(jié)腸腫瘤細(xì)胞中TFF3過表達(dá)的生物學(xué)意義，為臨床TFF3高表達(dá)結(jié)腸癌早期腫瘤轉(zhuǎn)移診斷提供具有潛在轉(zhuǎn)化意義新靶點(diǎn)并為臨床TFF3高表達(dá)結(jié)腸癌的分子分型提供新的解析視角及實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

5、
　　方法：
　　1.構(gòu)建表達(dá)載體及截短、突變載體質(zhì)粒，慢病毒介導(dǎo)實(shí)驗(yàn)用穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。
　　2.組織熒光染色觀察p84和Twist在結(jié)腸癌標(biāo)本的表達(dá)及共定位。
　　3.Western Blot驗(yàn)證p84，β-ARR1及Twist在TFF3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中蛋白水平表達(dá)。
　　4.Co-IP和TNT驗(yàn)證p84與Twist相互作用，進(jìn)一步通過RNAi干擾抑制B-ARR1表達(dá)，檢測(cè)p84與Twist的互作變化。
　

6、　5.Confocal顯微技術(shù)觀察TFF3誘導(dǎo)下，p84與Twist在細(xì)胞核質(zhì)共定位。
　　6.Western Blot分析p84WT、KA和KD對(duì)下游分子β-ARR1和Twist蛋白的表達(dá)及核質(zhì)分布影響。
　　7.Confocal顯微技術(shù)觀察p84KA和KD與Twist的共定位。
　　8.RNAi干擾或過表達(dá)β-ARR1，通過Western Blot方法檢測(cè)其對(duì)p84和Twist表達(dá)及核質(zhì)分布影響。
　　9.W

7、estern Blot技術(shù)驗(yàn)證TFF3-p84對(duì)組蛋白H3表達(dá)及其Serl0磷酸化調(diào)節(jié)。
　　10.Confocal顯微技術(shù)觀察TFF3誘導(dǎo)E-cad和Vimen的表達(dá)改變。
　　11.Western Blot驗(yàn)證p84介導(dǎo)TFF3調(diào)節(jié)EMT標(biāo)志分子蛋白變化。
　　12.Dual-Luciferase Assay System分析p84-Twist對(duì)TFF3下游E-cadherin啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性影響。
　　13.

8、細(xì)胞劃痕遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TFF3-p84-Twist通路對(duì)IEC遷移能力影響。
　　14.免疫組化，F(xiàn)isher's Exact Test及Spearman's檢驗(yàn)分析TFF3與磷酸化p84在結(jié)腸癌組織樣本中的相關(guān)性。
　　15.免疫組化分析磷酸化p84與Twist在不同組織類型結(jié)腸癌中表達(dá)定位相關(guān)性及Twist胞質(zhì)表達(dá)與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.TFF3增強(qiáng)β-ARR1介導(dǎo)的p84與Twist互作，并

9、誘導(dǎo)p84-Twist核質(zhì)共定位。
　　2.p84介導(dǎo)TFF3誘導(dǎo)β-ARR1和Twist表達(dá)上調(diào)，β-ARR1調(diào)節(jié)TFF3激活磷酸化p84核質(zhì)穿梭，激酶激活型p84入核促進(jìn)Twist出核。
　　3.TFF3-p84上調(diào)組蛋白H3表達(dá)并磷酸化H3-Serl0位點(diǎn)。
　　4.p84-Twist介導(dǎo)TFF3促進(jìn)IEC發(fā)生EMT相關(guān)的遷移。
　　5.磷酸化p84與TFF3在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)。磷酸化p84與腫瘤

10、的組織學(xué)分型、是否發(fā)生轉(zhuǎn)移及癌的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶相關(guān)。
　　6.磷酸化p84與Twist陽性表達(dá)在不同組織學(xué)分型的結(jié)腸癌中具有相關(guān)性，Twist胞質(zhì)表達(dá)與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。
　　結(jié)論：
　　1.β-ARR1介導(dǎo)TFF3誘導(dǎo)的p84-Twist復(fù)合物形成，且增強(qiáng)p84與Twist互作;磷酸化p84入核，調(diào)控TFF3誘導(dǎo)的Twist核質(zhì)穿梭。
　　2.p84介導(dǎo)TFF3-Twist調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT，并促進(jìn)遷