人結(jié)腸癌細(xì)胞GOLPH3基因與Wnt信號(hào)通路的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　結(jié)直腸癌組織中GOLPH3過(guò)表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，其機(jī)制與激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)GOLPH3基因與Wnt信號(hào)通路活性的相關(guān)性進(jìn)行研究，探討GOLPH3基因過(guò)表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　1、RT-PCR檢測(cè)HCT116、HT29、SW480及SW620四種人結(jié)腸癌細(xì)胞中GOLPH3 mRNA的表達(dá)情況，選擇表達(dá)水平最高的人結(jié)腸癌細(xì)胞株繼續(xù)進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

2、
　　2、將人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞株分為四個(gè)組：對(duì)照組、siRNA-GOLPH3轉(zhuǎn)染組、加Akt抑制劑Tricinbine組及加GSK-3β抑制劑TWS119組。
　　3、RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-GOLPH3后的沉默效果。
　　4、通過(guò)Topflash報(bào)告基因活性檢測(cè)各組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞Wnt信號(hào)通路的活性。
　　5、應(yīng)用MTT法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的

3、增殖情況。
　　6、利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的凋亡率。
　　7、Western Blot檢測(cè)各組結(jié)腸癌細(xì)胞中 GOLPH3、β-catenin、GSK-3β、pS9-GSK-3β蛋白的表達(dá)。
　　8、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，探討GOLPH3基因過(guò)表達(dá)通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1、RT-PCR法檢測(cè)四種人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、HT29、SW48

4、0及SW620中GOLPH3 mRNA的表達(dá)水平（1.00±0.097）、（2.872±0.064）、（1.957±0.133）與（3.958±0.169）。GOLPH3 mRNA在結(jié)腸癌SW620細(xì)胞株中表達(dá)水平最高，選擇人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620進(jìn)行后續(xù)的分組實(shí)驗(yàn)。
　　2、人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞GOLPH3 mRNA的表達(dá)水平分別為（1.000±0.092）和（0.236±0.076），轉(zhuǎn)染組表達(dá)水平顯著性低于

5、對(duì)照組（P<0.001），轉(zhuǎn)染效果良好。
　　3、對(duì)照組與三個(gè)實(shí)驗(yàn)組(siRNA-GOLPH3；加 Tricinbine；加 TWS119)SW620癌細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性（Relative Luciferase Activity），即相對(duì) RLU值分別為（1.000±0.164）與（0.342±0.061）、（0.359±0.125）、（0.365±0.155），三個(gè)實(shí)驗(yàn)組癌細(xì)胞的相對(duì)RLU值均明顯低于對(duì)照組（P<0.01），

6、并且各實(shí)驗(yàn)組間相互對(duì)比，癌細(xì)胞的RLU值無(wú)顯著差別（P>0.05）。
　　4、MTT法檢測(cè)對(duì)照組與三個(gè)實(shí)驗(yàn)組(siRNA-GOLPH3；加 Tricinbine；加 TWS119)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為0與59.9％、56.6%、51.3%，各實(shí)驗(yàn)組癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率均高于對(duì)照組（P<0.05），同時(shí)各實(shí)驗(yàn)組間互相對(duì)比，癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　5、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組及三個(gè)實(shí)驗(yàn)組(siR

7、NA-GOLPH3；加Tricinbine；加TWS119)SW620癌細(xì)胞的集落數(shù)分別為（207.333±17.786）、（82.333±15.144）、（93.333±12.342）、（95.667±16.563），各實(shí)驗(yàn)組癌細(xì)胞集落數(shù)均顯著低于對(duì)照組（P<0.001），在各實(shí)驗(yàn)組間的比較顯示癌細(xì)胞的克隆能力無(wú)差異性（P>0.05）。
　　6、對(duì)照組與三個(gè)實(shí)驗(yàn)組(siRNA-GOLPH3；加 Tricinbine；加 TWS1

8、19)SW620癌細(xì)胞的凋亡率分別為（1.680±0.576）%與（52.467±4.373）%、（46.167±5.293）%、（50.167±6.506）%，實(shí)驗(yàn)組癌細(xì)胞的凋亡比例均顯著性增加（P<0.001），且各實(shí)驗(yàn)組間互相比較顯示癌細(xì)胞的凋亡情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　7、Western Blot檢測(cè)結(jié)果：
　　與對(duì)照組比較：
　　①在siRNA-GOLPH3組:癌細(xì)胞GOLPH3蛋白表達(dá)明顯

9、下降（P<0.001）,β-catenin蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.001）,GSK-3β蛋白表達(dá)無(wú)差別（P>0.05）,pS9-GSK3β蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.001）；
　?、诩覶ricinbine組：GOLPH3蛋白表達(dá)無(wú)差異（P>0.05）,β-catenin蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.001），GSK-3β蛋白表達(dá)無(wú)差異（P>0.05），pS9-GSK3β蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.001）；
　?、奂覶WS119

10、組：GOLPH3蛋白表達(dá)無(wú)差別（P>0.05）,β-catenin蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.001），GSK-3β蛋白表達(dá)無(wú)差異（P>0.05），pS9-GSK3β蛋白表達(dá)顯著下降（P<0.001）。
　　各實(shí)驗(yàn)組比較：
　?、貵OLPH3蛋白的表達(dá)在 siRNA-GOLPH3組低于加 Tricinbine組及加 TWS119組（P<0.05），并且后兩組間表達(dá)無(wú)差異性（P>0.05）；
　?、谠?siRNA-GOLP

11、H3組及加 Tricinbine組中β-catenin蛋白的表達(dá)無(wú)差別（P>0.05），但均低于加TWS119組的表達(dá)（P<0.05）；
　?、跥SK-3β蛋白及 pS9-GSK3β蛋白在各實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、GOLPH3基因過(guò)表達(dá)可激活Wnt信號(hào)通路，上調(diào)β-catenin表達(dá)，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，抑制凋亡；
　　2、Akt、GSK3β活化可開(kāi)啟Wnt信號(hào)通路