Wnt5a信號通路在結(jié)腸癌血管生成擬態(tài)及EMT中的作用.pdf

1、研究背景和目的:
　　結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病較為廣泛的惡性腫瘤之一，腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)嚴(yán)重威脅結(jié)腸癌病人的生命。腫瘤的生長以及轉(zhuǎn)移需依賴腫瘤組織中的血管生成。血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry, VM)是一種不依賴內(nèi)皮細(xì)胞的全新腫瘤微循環(huán)模式，已有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)多種惡性腫瘤中存在VM，如肝癌、前列腺癌、卵巢癌等。前期研究結(jié)論證實(shí)結(jié)腸癌中存在VM，且VM與腫瘤的惡性度相關(guān)，與臨床不良預(yù)后有關(guān)。結(jié)腸癌中VM的詳細(xì)形成機(jī)

2、制至今不明，已有研究結(jié)果證實(shí)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)以及經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的過度活化在結(jié)腸癌VM形成中起重要作用。本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌組織中存在Wnt/β-catenin信號通路的過度活化并且參與啟動EMT。已有研究報(bào)道稱非經(jīng)典Wnt信號通路可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移，通過激活轉(zhuǎn)錄因子啟動EMT。非經(jīng)典Wnt信號通路中最重要的Wnt分泌蛋白Wnt5

3、a在胃癌、乳腺癌、前列腺癌等中存在促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的作用，Wnt5a可促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT。而非經(jīng)典Wnt信號通路在結(jié)腸癌中的作用研究卻相對甚少且不一致，因此我們遴選非經(jīng)典Wnt信號通路中Wnt5a作為研究對象，探討Wnt5a信號通路在結(jié)腸癌VM形成機(jī)制中可能存在的作用。
　　本研究利用免疫組化技術(shù)初步分析了217例結(jié)腸癌病例組織中Wnt5a的表達(dá)情況，并結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步探討Wnt5a與EMT相關(guān)蛋白以及VM形成的

4、關(guān)系，并利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)及免疫缺陷小鼠腫瘤細(xì)胞移植瘤模型進(jìn)一步探究Wnt5a對結(jié)腸癌細(xì)胞EMT及VM形成的影響，以期闡明非經(jīng)典Wnt信號通路在結(jié)腸癌中的作用。
　　研究方法:
　　1)免疫組織化學(xué)染色方法檢測217例結(jié)腸癌組織標(biāo)本中Wnt5a的表達(dá)，并結(jié)合臨床病理資料以及生存情況隨訪記錄結(jié)果，分析Wnt5a的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系以及.Wnt5a的表達(dá)與患者生存預(yù)后的關(guān)系。結(jié)合前期試驗(yàn)結(jié)果，分析Wnt5a的

5、表達(dá)與結(jié)腸癌中EMT相關(guān)蛋白E-cadherin以及Vimentin的關(guān)系，以及與結(jié)腸癌中經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵調(diào)控蛋白β-catenin的關(guān)系。
　　2)建立異常Wnt5a基因表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞系，驗(yàn)證Wnt5a基因過表達(dá)以及降表達(dá)效果，篩選穩(wěn)定過或者降表達(dá)Wnt5a的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞。
　　3) Western Blot以及免疫熒光檢測Wnt5a對結(jié)腸癌EMT以及經(jīng)典Wnt/β-catenin信號

6、通路的影響。
　　4)MTT實(shí)驗(yàn)以及軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Wnt5a對HCT116細(xì)胞增殖能力的影響作用;劃痕實(shí)驗(yàn)以及侵襲實(shí)驗(yàn)檢測Wnt5a對HCT116細(xì)胞運(yùn)動遷移以及侵襲能力的影響;細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測Wnt5a對細(xì)胞粘附的作用。
　　5)動物實(shí)驗(yàn)體內(nèi)檢測Wnt5a對結(jié)腸癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響，并以免疫組化染色方法檢測移植瘤中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　6)細(xì)胞流式術(shù)檢測Wnt5a對結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響作用。

7、
　　7)通過細(xì)胞三維培養(yǎng)技術(shù)檢測Wnt5a對結(jié)腸癌細(xì)胞成管能力的影響，并通過Real-time PCR以及Western Blot檢測Wnt5a對血管生成相關(guān)蛋白的作用。
　　結(jié)果:
　　1) Wnt5a在結(jié)腸癌中表達(dá)下降，Wnt5a陽性表達(dá)與患者的良好臨床預(yù)后有關(guān)。Wnt5a的表達(dá)與結(jié)腸癌EMT相關(guān)蛋白呈負(fù)性相關(guān)關(guān)系。Wnt5a可能通過抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路活化來抑制EMT。Wnt5a在VM陰性

8、患者的表達(dá)比率較高，提示W(wǎng)nt5a可能抑制結(jié)腸癌中VM的形成。
　　2) Wnt5a在結(jié)腸癌細(xì)胞系中普遍呈低表達(dá)狀態(tài)，成功構(gòu)建基因調(diào)控Wnt5a表達(dá)的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞。
　　3) Wnt5a可通過下調(diào)EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子抑制結(jié)腸癌細(xì)胞EMT過程，結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116中過表達(dá)Wnt5a后可拮抗經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路。
　　4) Wnt5a過表達(dá)可明顯抑制HCT116細(xì)胞的增殖;Wnt5a可抑制結(jié)

9、腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力;Wnt5a可增強(qiáng)細(xì)胞粘附能力。
　　5) Wnt5a抑制體內(nèi)小鼠體內(nèi)移植瘤的生長，且抑制瘤體組織中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　6) Wnt5a可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，從而激活Wnt/Ca2+信號途徑。
　　7) Wnt5a抑制HCT116細(xì)胞管道樣結(jié)構(gòu)的形成能力，并抑制促血管生成因子蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　Wnt5a作為抑癌基因在結(jié)腸癌中呈普遍性低表達(dá)或者失表達(dá)，Wn