WNT5A對胰腺癌細胞化療耐藥及腫瘤血管生成作用的研究.pdf

1、背景:胰腺癌(Pancreatic carcinoma，PC)是胰腺組織的惡性腫瘤，WNT5A由胰腺癌細胞(Pancreatic carcinoma cells，PCCs)產(chǎn)生，在腫瘤的進展過程中起重要作用。目前，有關WNT5A在胰腺癌組織中表達的病例分析比較缺乏。并且，雖然已有報道WNT5A激活PCCs的侵襲和遷移，但有關WNT5A在胰腺癌化療耐藥和血管生成方面的作用還有待研究。
　　目的:本文通過對WNT5A在胰腺癌病理組織中

2、的表達，以及WNT5A在PCCs對吉西他濱的耐藥、血管生成方面作用的研究，為胰腺癌的治療提供新的思路。方法:
　　1.收集手術切除并經(jīng)病理確診的胰腺癌標本68例，通過免疫組織化法對腫瘤和癌旁組織的WNT5A表達量進行分析，并分析其與年齡、性別、臨床TNM分期、腫瘤分級、發(fā)生部位和腫瘤大小之間的關系;
　　2.通過小RNA干擾方法干擾WNT5A，檢測在干擾前后胰腺癌細胞系PANC-1，MiaPaCa2和Capan-2對吉西他濱

3、敏感性變化。構建WNT5A干擾和過表達質粒系統(tǒng)，建立穩(wěn)定轉染細胞，并應用CCK8細胞毒實驗技術驗證轉染細胞對吉西他濱耐藥性的改變。
　　3.應用流式細胞技術研究干擾WNT5A對細胞周期的影響。應用實時定量PCR方法檢測細胞周期蛋白的mRNA相對表達水平。應用Western blotting對WNT5A影響細胞周期蛋白的機制進行研究，尋找WNT5A作用靶點激酶。通過免疫沉淀實驗研究WNT5A調控細胞周期時相的機制。
　　4.通

4、過免疫印跡檢測缺氧誘導因子HIF-1α的表達量，并通過細胞免疫熒光實驗檢測其在細胞質/細胞核的表達改變。應用實時定量PCR檢測血管內皮生長因子VEGF的轉錄水平，并通過ELISA試劑盒檢測PCCs上清液中VEGF的表達量;
　　5.應用Transwell小室共培養(yǎng)PCCs和人臍靜脈內皮細胞HUVECs，通過細胞計數(shù)檢測HUVECs細胞增殖情況，通過劃痕實驗和Transwell實驗檢測細胞遷移情況;
　　6.構建BALB/c裸

5、鼠異體移植瘤模型，測量裸鼠腫瘤大小計算體積，繪制腫瘤
　　增長曲線。接種30天后取瘤進行免疫組化，分析移植瘤中HIF-1α的表達量，并通過CD34染色計算微血管密度。
　　結果:
　　1.免疫組化結果顯示，WNT5A在胰腺癌中呈陽性表達在癌旁組織中呈陰-弱陽性表達，并且WNT5A染色評分與臨床分期與腫瘤大小相關，隨著TNM分期增加，WNT5A染色強度增加;
　　2.敲除WNT5A造成PANC-1、MiaPaCa2

6、和Capan-2對吉西他濱耐受性下降，通過構建穩(wěn)定干擾和過表達WNT5A的PANC-1細胞系，同樣觀測到其對吉西他濱的耐受性隨著WNT5A的改變而改變;
　　3.通過流式測細胞周期發(fā)現(xiàn)干擾WNT5A導致細胞周期G1期停滯，Cyclin DmRNA水平的下降，這種改變伴隨ser473AKT磷酸化，抑制PI3K/AKT可以阻斷WNT5A對Cyclin D蛋白表達的促進作用。通過對G1/S限制點調控蛋白pRb-E2F的檢測，發(fā)現(xiàn)干擾WN

7、T5A可以穩(wěn)定pRb，使pRb-E2F復合物構象穩(wěn)定，強化限制點功能;
　　4.WNT5A可以增加HIF-1α的穩(wěn)定性，并且促進其細胞核轉移，從而激活其靶基因VEGF mRNA水平增加和蛋白分泌增加;
　　5.共培養(yǎng)PCCs和HUVECs促進后者增殖和遷移能力，體內實驗證實干擾WNT5A導致胰腺癌腫瘤生長停滯，微血管密度減少。
　　結論:
　　1.WNT5A在胰腺癌中高表達，并且與TNM分期相關;
　　2.